該研究為這一難題提供了全新解決方案：神經(jīng)肽SP（Substance?P）可通過(guò)重塑腸道菌群、促進(jìn)菌群代謝物肌醇生成，同步改善DSS誘導的結腸炎與焦慮樣行為。這項研究不僅首次闡明了“SP-腸道菌群-肌醇-海馬體信號通路”的完整調控鏈，更以多組學(xué)技術(shù)與嚴謹的動(dòng)物實(shí)驗驗證其機制，為IBD合并精神障礙的治療開(kāi)辟了新賽道。百邁客生物為該研究提供了非靶向代謝組和16S?rRNA測序服務(wù)。

研究背景

炎癥性腸?。↖BD）包含潰瘍性結腸炎和克羅恩病，是一種慢性腸道炎癥疾病，患者焦慮發(fā)生率高達?30%、抑郁發(fā)生率達?25%，但腸道外的精神癥狀常被忽視。腸-腦軸介導腸道炎癥與精神癥狀的關(guān)聯(lián)，腸道微生物群及其代謝物通過(guò)腸?–?腦軸調控腦功能，但硫酸葡聚糖鈉（DSS）誘導的腸道菌群變化如何影響情緒相關(guān)中樞系統尚不明確。

神經(jīng)肽P物質(zhì)（SP）在腸-腦軸各層面均有表達，已被證實(shí)具有抗炎、神經(jīng)保護作用，且能改善DSS誘導的急性結腸炎，但SP是否通過(guò)腸道微生物群調控腸道屏障功能和中樞神經(jīng)系統以改善焦慮樣癥狀，尚未明確。

研究結果

SP改善DSS誘導的小鼠結腸炎癥狀

該研究采用DSS處理成功誘導出結腸炎小鼠模型。為評估SP在結腸炎發(fā)病機制中的作用通過(guò)靜脈注射SP干預，從“腸道病理-腸道屏障-炎癥因子-行為學(xué)”?多維度驗證SP的保護作用。

SP處理顯著(zhù)降低疾病活動(dòng)指數（DAI），減輕體重下降，恢復結腸長(cháng)度，降低脾臟?/?體重比。HE染色顯示，SP處理組結腸黏膜上皮完整、隱窩結構正常，黏膜下層無(wú)明顯水腫和炎癥細胞浸潤，組織學(xué)評分顯著(zhù)低于DSS組；透射電鏡觀(guān)察到SP修復DSS導致的腸上皮細胞間隙增寬、微絨毛縮短卷曲。腸道屏障功能修復AB-PAS染色顯示SP緩解DSS誘導的杯狀細胞減少；免疫熒光證實(shí)SP上調腸道黏液屏障關(guān)鍵成分MUC-2的表達；FITC-葡聚糖檢測表明SP降低腸道通透性，減少外來(lái)物質(zhì)滲漏。Luminex檢測顯示，SP顯著(zhù)降低結腸組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ等促炎因子水平，且SP單獨處理組無(wú)明顯異常癥狀。

DSS撤藥后腸道炎癥消退，SP仍能改善殘留焦慮樣行為，表明其對腸腦軸的調控不依賴(lài)腸道炎癥緩解，具有獨立性。

圖1 SP改善DSS誘導小鼠的結腸炎癥狀及焦慮樣行為

SP可減輕DSS誘導小鼠的海馬損傷及神經(jīng)炎癥

海馬損傷可影響情緒調節中樞的功能，進(jìn)而導致抑郁和焦慮等精神障礙。通過(guò)組織學(xué)染色、細胞標記與細胞因子檢測，探究SPSP在減輕神經(jīng)炎癥中的作用。

SP顯著(zhù)減輕DSS誘導的海馬體神經(jīng)元丟失、核固縮、尼氏小體減少等病理?yè)p傷，維持神經(jīng)元形態(tài)完整。檢測了海馬組織中炎癥介質(zhì)的濃度，結果顯示，SP顯著(zhù)降低了DSS處理小鼠海馬中IL-1β、?TNF?-α、IL-9、?IFN?-γ、IL-13、IL-6、G-CSF、GM-CSF、?MIP?-1β和IL-12P70的水平，但提高了IL-4、IL-5和IL-10的水平，結果表明，SP通過(guò)調節促炎細胞因子與抗炎因子之間的平衡，減輕了DSS誘導的海馬神經(jīng)炎癥。

為探究SP對小膠質(zhì)細胞/星形膠質(zhì)細胞的影響，統計了各組海馬區這兩種細胞的數量。發(fā)現SP減少DSS誘導的Iba-1陽(yáng)性小膠質(zhì)細胞數量（抑制小膠質(zhì)細胞活化），增加GFAP陽(yáng)性星形膠質(zhì)細胞數量（防止星形膠質(zhì)細胞丟失）；Western?blot證實(shí)SP降低M1型小膠質(zhì)細胞標志物iNOS的表達，上調星形膠質(zhì)細胞標志物GFAP的表達。合理推斷，SP通過(guò)減輕結腸炎小鼠海馬區的病理?yè)p傷和神經(jīng)炎癥，改善了其焦慮樣行為，這可能與抑制小膠質(zhì)細胞向M1表型極化及防止星形膠質(zhì)細胞丟失有關(guān)。

圖2 SP減輕DSS誘導小鼠的海馬損傷及神經(jīng)炎癥反應

SP改善DSS誘導小鼠腸道菌群失調并改變微生物組功能

探究SP是否通過(guò)腸道菌群發(fā)揮作用，通過(guò)16S?rRNA測序分析SP對DSS誘導菌群失調的調控作用，結合PICRUSt2預測菌群代謝功能。

與DSS誘導組相比，SP對腸道菌群豐富度和多樣性均未產(chǎn)生顯著(zhù)影響，PCoA分析顯示CON組、DSS組和DSS+SP組之間存在顯著(zhù)差異，表明細菌群落結構存在顯著(zhù)差異。在門(mén)水平，SP?顯著(zhù)提高厚壁菌門(mén)（Firmicutes）相對豐度，降低擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）和變形菌門(mén)（Proteobacteria）豐度。在科水平，SP?增加毛螺菌科（Lachnospiraceae）、鼠桿菌科（Muribaculaceae）豐度，降低擬桿菌科（Bacteroidaceae）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）豐度。在屬水平，DSS+SP組中擬桿菌屬（Bacteroides）和擬桿菌亞屬（Alistipes）的相對豐度降低，而unclassified_Lachnospiraceae、unclassified_Muribaculaceae和?Lachnospiraceae_NK4A136_group的相對豐度上調。PICRUSt2預測顯示，SP顯著(zhù)激活肌醇磷酸代謝、膽汁分泌、NOD?樣受體信號通路等功能模塊，抑制戊糖磷酸途徑、生物膜形成等DSS誘導的異常功能模塊。

圖3 SP可改善DSS誘導小鼠的腸道菌群失調并改變微生物組功能

SP通過(guò)調節腸道菌群預防DSS誘導的腸道損傷及焦慮樣障礙

為驗證腸道菌群是否為SP發(fā)揮作用的必需環(huán)節，進(jìn)行了抗生素耗竭實(shí)驗驗證。ABX處理14天成功構建偽無(wú)菌小鼠模型后，SP對DSS誘導的結腸炎癥狀（DAI、體重、結腸長(cháng)度、腸道結構）和焦慮樣行為的改善作用顯著(zhù)減弱，表明SP的保護作用依賴(lài)腸道菌群。

同時(shí)進(jìn)行了糞便微生物移植（FMT）實(shí)驗驗證，FMT-DSS+SP組表現出更輕的體重下降、更低的DAI、緩解結腸縮短以及降低的脾臟/體重比，腸道黏膜損傷減輕，杯狀細胞數量增加，TNF-α、IL-6等促炎因子水平降低，MPO活性減弱。FMT-DSS+SP組小鼠海馬神經(jīng)元損傷也得到了緩解，促炎因子（TNF-α、IL-1β）mRNA表達降低，抗炎因子IL-4表達升高，小膠質(zhì)細胞M1表型（iNOS、CD80）表達降低，M2表型（CD206）表達升高，星形膠質(zhì)細胞GFAP表達上調。此外腸道菌群結構也與FMT-DSS組存在顯著(zhù)差異，厚壁菌門(mén)、未分類(lèi)鼠桿菌科等有益菌群豐度升高，擬桿菌屬等有害菌群豐度降低。

直接證實(shí)SP的保護作用依賴(lài)腸道菌群，排除SP直接穿過(guò)血腦屏障發(fā)揮作用的可能，明確菌群是SP調控腸腦軸的核心“中間人”。

圖4 SP以腸道微生物群依賴(lài)性方式預防DSS誘導的腸道損傷及焦慮樣障礙

圖5 FMT實(shí)驗表明SP通過(guò)調節腸道菌群減輕了DSS誘導的結腸炎和焦慮樣行為

SP通過(guò)調控腸道菌群影響海馬基因表達，涉及NF-κB和GABAergic/Ca2?信號通路

通過(guò)轉錄組測序分析FMT處理小鼠海馬體的差異表達基因，結合WB、免疫熒光染色，明確SP調控菌群后對腦內信號通路的影響。

RNA-seq顯示，FMT-DSS與FMT-CON組存在436個(gè)差異表達基因（DEGs），FMT-DSS+SP組與FMT-DSS組存在387個(gè)DEGs，其中158個(gè)基因為共同調控基因。KEGG分析顯示DSS組NF-κB通路激活，而SP通過(guò)菌群抑制其激活。qRT-PCR和Western?blot證實(shí)，SP降低海馬組織中IKBα、p65?的mRNA表達及p-p65、p-IKBα的蛋白表達；免疫熒光顯示SP減少小膠質(zhì)細胞中p-IKBα陽(yáng)性信號，抑制小膠質(zhì)細胞NF-κB通路激活。KEGG分析顯示SP激活神經(jīng)活性配體-受體相互作用和Ca2?信號通路。qRT-PCR顯示SP上調海馬組織中Gabra1、Gabra3、Gabrb2、Camk2d等基因表達；Western?blot證實(shí)SP增加GABA_A?Rα1、GABA_B?R2、GAD65（GABA?合成關(guān)鍵酶）和CaMKII（鈣濃度傳感器）的蛋白表達。

免疫熒光顯示SP增強星形膠質(zhì)細胞中GABA_A?Rα1和CaMKII的陽(yáng)性表達；流式分選細胞RNA-seq顯示，SP抑制小膠質(zhì)細胞中NF-κB通路相關(guān)基因富集，促進(jìn)星形膠質(zhì)細胞中GABA能突觸和鈣信號通路相關(guān)基因富集。

圖6 SP通過(guò)調節腸道微生物組影響海馬基因的表達

SP增強腸道微生物源性代謝物肌醇的富集

腸道菌群通過(guò)代謝物介導腸腦軸溝通，采用非靶向代謝組學(xué)分析DSS、DSS+SP、CON三組小鼠的結腸內容物代謝譜，篩選SP調控的關(guān)鍵代謝物。

PLS-DA分析顯示，三組代謝譜存在顯著(zhù)分離，DSS+SP組代謝表型更接近CON?組，表明SP可逆轉?DSS?誘導的代謝紊亂。共鑒定出395個(gè)差異代謝物，其中肌醇（inositol）是SP干預后升高最顯著(zhù)的代謝物之一，且富集于肌醇磷酸代謝、半乳糖代謝等通路。

Spearman相關(guān)性分析顯示，肌醇水平與有益菌群呈正相關(guān)，與結腸炎嚴重程度呈負相關(guān)，提示肌醇可能是菌群介導?SP?保護作用的關(guān)鍵?“信使分子”。

圖7 SP可增強腸道微生物群源代謝物肌醇的富集

肌醇給藥可改善DSS誘導的結腸炎及焦慮樣障礙

通過(guò)飲水給予DSS誘導的結腸炎小鼠2%肌醇干預，驗證肌醇是否能單獨模擬SP的雙向保護作用。

肌醇顯著(zhù)抑制DSS誘導的體重丟失和DAI升高，恢復結腸長(cháng)度，修復腸道上皮損傷，上調E-cadherin，降低結腸組織中IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表達。肌醇處理組在開(kāi)放場(chǎng)試驗中移動(dòng)距離、中央區域活動(dòng)增加，在高架十字迷宮中開(kāi)放臂停留時(shí)間和進(jìn)入次數增加，焦慮樣行為緩解。肌醇緩解?DSS?誘導的海馬神經(jīng)元核固縮和尼氏小體丟失，降低海馬組織中促炎因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）mRNA?表達，升高抗炎因子IL-10表達；減少I(mǎi)ba-1陽(yáng)性小膠質(zhì)細胞數量，促進(jìn)GABA合成與受體表達，增加星形膠質(zhì)細胞及GAT1免疫陽(yáng)性表達。而單獨補充肌醇組與對照組（CON）相比，未觀(guān)察到明顯的腸道病理學(xué)和行為學(xué)改變。綜上，這些數據表明肌醇可能是SP發(fā)揮有益效應的關(guān)鍵候選代謝物。

圖8 腸道代謝物肌醇介導SP對DSS誘導小鼠結腸炎及焦慮行為的保護作用

肌醇在SP對DSS誘導小鼠焦慮樣行為的作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用

用肌醇合成抑制劑L-690330干預，驗證肌醇是否為SP發(fā)揮作用的必需分子；同時(shí)通過(guò)體外細胞實(shí)驗，驗證肌醇對小膠質(zhì)細胞與星形膠質(zhì)細胞的直接調控作用。

L-690330處理后，SP對DSS小鼠的抗焦慮作用及海馬體保護效應被顯著(zhù)逆轉。肌醇水平升高：FMT-DSS+SP組小鼠海馬體與血清中肌醇濃度顯著(zhù)高于FMT-DSS組，證實(shí)菌群衍生的肌醇可進(jìn)入血液循環(huán)并作用于大腦。體外細胞驗證：①?小膠質(zhì)細胞（BV-2）：100μM肌醇可顯著(zhù)降低LPS誘導的TNF-α、IL-1β、IL-6?等促炎因子表達，無(wú)細胞毒性；②?星形膠質(zhì)細胞（C8D1A）：肌醇可逆轉LPS誘導的GABA受體及CaMKII蛋白表達下調，激活GABAergic/Ca2?信號通路。

明確肌醇在SP調控通路中的“不可替代”地位，同時(shí)證實(shí)肌醇可直接調控神經(jīng)細胞功能，完善“菌群代謝物?–?腦”的調控鏈條。

圖9 肌醇在SP對DSS誘導小鼠焦慮樣行為的作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用

研究總結

SP通過(guò)調節腸道菌群結構，促進(jìn)有益菌群產(chǎn)生肌醇；肌醇進(jìn)入循環(huán)后作用于海馬體，一方面抑制小膠質(zhì)細胞NF-κB促炎通路，減輕神經(jīng)炎癥；另一方面激活星形膠質(zhì)細胞GABAergic/Ca2?信號通路，增強抗焦慮神經(jīng)傳導；最終實(shí)現對結腸炎的腸道保護與焦慮樣行為的神經(jīng)調節，形成“SP-腸道菌群-肌醇-海馬體”的完整調控軸。

褪黑素通過(guò)調節小鼠腸道菌群預防肥胖

IF：9.314 期刊：Journal of Pineal Research

時(shí)間：2017.03

單位：北京師范大學(xué) 、百邁客生物科技

研究背景

肥胖是一個(gè)非常嚴重的健康威脅因素，在2014年全球體重超標的成年人達到20億，其中至少有6億是肥胖癥。有大量研究表明肥胖是癌癥和一些慢性疾病，如糖尿病、脂肪肝、心血管疾病等的風(fēng)險因素?，F如今肥胖已經(jīng)超越吸煙，成為世界范圍內最嚴重的健康威脅。目前研究表明腸道菌群失調會(huì )導致肥胖及其并發(fā)癥的發(fā)生。已有研究揭示褪黑素可以促進(jìn)體重的下降以及自身能量的平衡，但是褪黑素的益生作用是否與腸道微生態(tài)有關(guān)，目前尚未報導。而本研究發(fā)現，褪黑素是通過(guò)改變腸道微生物結構來(lái)預防肥胖及其并發(fā)疾病。

研究方法

小鼠隨機分為3組，NCD（正常膳食）、HFD（高脂肪膳食）、HFD+M（高脂肪膳食+褪黑素）

Illumina?MiSeq；16S?rRNA?V3+V4;

組織學(xué)分析，生化分析，葡萄糖和胰島素耐受分析，蛋白質(zhì)印記分析。

研究成果

1，?褪黑素能顯著(zhù)地控制體重增加

1）?HFD組小鼠體重顯著(zhù)增加，而HFD+褪黑素組小鼠體重得到有效控制，如下圖A。

2）分離小鼠四類(lèi)主要的脂肪組織（Epi-WAT、Mes-WAT、Per-WAT、Ing-SAT），發(fā)現HFD顯著(zhù)促進(jìn)這四類(lèi)脂肪組織重量的增加，而褪黑素能有效抑制這四類(lèi)脂肪組織重量的增加，如下圖B-E。

2，?褪黑素能控制白色脂肪組織，脂肪肝，系統性炎癥

1）?通過(guò)比較Epi-WAT脂肪細胞的大小，發(fā)現HFD組脂肪細胞顯著(zhù)增大；而褪黑素通過(guò)減少>12000μm2的細胞數目，增加2000–8000μm2的細胞數目，使HFD+褪黑素組脂肪細胞大小維持在正常范圍內，如下圖A-C。

2）?通過(guò)比較Epi-WAT脂肪生成基因（FAS和ACC-1）的表達量，發(fā)現HFD顯著(zhù)促進(jìn)FAS和ACC-1的表達，而褪黑素顯著(zhù)抑制FAS基因的表達，如下圖D和E。

3）?通過(guò)觀(guān)察油紅O染色及比較肝臟TC含量，發(fā)現褪黑素能顯著(zhù)抑制肝臟內脂質(zhì)積累，如下圖F和G。

4）?通過(guò)比較血液內毒素（LPS）和炎癥性細胞因子（TNFα和IL-6）的水平，發(fā)現褪黑素能顯著(zhù)抑制內毒素血癥和系統性炎癥的發(fā)生，如下圖H-K。

3，?褪黑素能改善葡萄糖耐受性及胰島素抗性

1）?通過(guò)比較血脂含量，發(fā)現HFD顯著(zhù)提高TG和TC含量，而褪黑素能顯著(zhù)降低TG和TC的含量，如下圖A和B。

2）?通過(guò)比較血糖和胰島素含量，并推導HOMA-IR和QUICKI指數，發(fā)現褪黑素能有效保護胰島素敏感性，并且使血糖和胰島素的含量發(fā)生顛倒，從而使HOMA-IR和QUICKI指數趨于正常水平，如下圖C-F。

3）?通過(guò)葡萄糖耐受試驗（IPGTT）和胰島素耐受試驗（ITT）分析，發(fā)現褪黑素能顯著(zhù)改善葡萄糖耐受性及胰島素抗性，如下圖G和H。

4，?褪黑素能促進(jìn)棕色脂肪組織褐變及產(chǎn)熱

1）?通過(guò)棕色脂肪組織（BAT）石蠟切片分析，發(fā)現HFD促進(jìn)脂質(zhì)積累（切片白化），而褪黑素表現出相反的作用，并且褪黑素促進(jìn)BAT中UCP1蛋白的表達，如下圖A。

在BAT中，褪黑素顯著(zhù)增強產(chǎn)熱基因UCP1和UCP3的表達，如下圖B和C；線(xiàn)粒體生物合成基因PGC1α，脂肪酸分解代謝基因CPT1β，脂質(zhì)轉運基因CD36?和FABP的表達量也有提高，盡管未達到統計學(xué)的顯著(zhù)性，如下圖D-G。

5，?褪黑激素改變腸道微生物結構

1）?通過(guò)對小鼠腸道菌群結構分析，發(fā)現褪黑素能顯著(zhù)降低OTU的數目以及微生物的豐富度和多樣性，如下圖A-H。

2）?門(mén)水平菌落結構分析，發(fā)現HFD顯著(zhù)降低擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）的相對豐度，而顯著(zhù)提高厚壁菌門(mén)（Firmicutes）的相對豐度。而褪黑素的加入會(huì )降低厚壁菌門(mén)/擬桿菌門(mén)的比例，并且會(huì )顯著(zhù)提高疣微菌門(mén)（verrucomicrobia）的相對豐度，如下圖I。

3）?屬水平菌落結構分析，發(fā)現褪黑素顯著(zhù)提高Akkermansia的相對豐度，Akkermansia屬于疣微菌門(mén)（verrucomicrobia），如下圖J。

4）?UPGMA、NMDS、PCA、PCoA分析，發(fā)現褪黑素顯著(zhù)改變了腸道菌群的結構，如下圖K-N。

6，褪黑素能調節腸道菌群中的標志微生物

1) ?如下圖顯示，在三個(gè)分組中一共找到85個(gè)相對豐度有顯著(zhù)差異的OUT。與NCD組相比，HFD組有27個(gè)相對豐度顯著(zhù)增高的OTU，42個(gè)顯著(zhù)降低的OTU。與HFD組相比，添加了褪黑素的組有10個(gè)相對豐度顯著(zhù)增高的OTU，20個(gè)顯著(zhù)降低的OTU；而在這30個(gè)差異性的OTU中，有14個(gè)OTU的變化方向與和NCD組比較的結果完全相反。這14個(gè)OTU屬于Ruminococcaceae、Desulfovibrionaceae、Bacteroides、Porphyromonadaceae、Helicobacteraceae、Christensenellaceae，有研究表明這些微生物與肥胖相關(guān)。

2) LEfSe分析，發(fā)現褪黑素顯著(zhù)提高Akkermansia的相對豐度，Akkermansia即是降低高脂肪膳食小鼠體重的有益菌。而褪黑素顯著(zhù)降低Alistipes、Anaerotruncus、Helicobacter?marmotae的相對豐度，則這三種細菌預防肥胖的有害菌?？傊?，褪黑素能夠使高脂肪膳食小鼠的腸道菌群由失調狀態(tài)轉為正常狀態(tài)，從而抑制體重的增加。

參考文獻：

Xu?P,?Wang?J,?Hong?F,?et?al.?Melatonin?prevents?obesity?through?modulation?of?gut?microbiota?in?mice[J].?Journal?of?Pineal?Research,?2017.