該研究為這一難題提供了全新解決方案：神經(jīng)肽SP（Substance?P）可通過(guò)重塑腸道菌群、促進(jìn)菌群代謝物肌醇生成，同步改善DSS誘導的結腸炎與焦慮樣行為。這項研究不僅首次闡明了“SP-腸道菌群-肌醇-海馬體信號通路”的完整調控鏈，更以多組學(xué)技術(shù)與嚴謹的動(dòng)物實(shí)驗驗證其機制，為IBD合并精神障礙的治療開(kāi)辟了新賽道。百邁客生物為該研究提供了非靶向代謝組和16S?rRNA測序服務(wù)。
研究背景
炎癥性腸?。↖BD）包含潰瘍性結腸炎和克羅恩病，是一種慢性腸道炎癥疾病，患者焦慮發(fā)生率高達?30%、抑郁發(fā)生率達?25%，但腸道外的精神癥狀常被忽視。腸-腦軸介導腸道炎癥與精神癥狀的關(guān)聯(lián)，腸道微生物群及其代謝物通過(guò)腸?–?腦軸調控腦功能，但硫酸葡聚糖鈉（DSS）誘導的腸道菌群變化如何影響情緒相關(guān)中樞系統尚不明確。
神經(jīng)肽P物質(zhì)（SP）在腸-腦軸各層面均有表達，已被證實(shí)具有抗炎、神經(jīng)保護作用，且能改善DSS誘導的急性結腸炎，但SP是否通過(guò)腸道微生物群調控腸道屏障功能和中樞神經(jīng)系統以改善焦慮樣癥狀，尚未明確。
研究結果
SP改善DSS誘導的小鼠結腸炎癥狀
該研究采用DSS處理成功誘導出結腸炎小鼠模型。為評估SP在結腸炎發(fā)病機制中的作用通過(guò)靜脈注射SP干預，從“腸道病理-腸道屏障-炎癥因子-行為學(xué)”?多維度驗證SP的保護作用。
SP處理顯著(zhù)降低疾病活動(dòng)指數（DAI），減輕體重下降，恢復結腸長(cháng)度，降低脾臟?/?體重比。HE染色顯示，SP處理組結腸黏膜上皮完整、隱窩結構正常，黏膜下層無(wú)明顯水腫和炎癥細胞浸潤，組織學(xué)評分顯著(zhù)低于DSS組；透射電鏡觀(guān)察到SP修復DSS導致的腸上皮細胞間隙增寬、微絨毛縮短卷曲。腸道屏障功能修復AB-PAS染色顯示SP緩解DSS誘導的杯狀細胞減少；免疫熒光證實(shí)SP上調腸道黏液屏障關(guān)鍵成分MUC-2的表達；FITC-葡聚糖檢測表明SP降低腸道通透性，減少外來(lái)物質(zhì)滲漏。Luminex檢測顯示，SP顯著(zhù)降低結腸組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ等促炎因子水平，且SP單獨處理組無(wú)明顯異常癥狀。
DSS撤藥后腸道炎癥消退，SP仍能改善殘留焦慮樣行為，表明其對腸腦軸的調控不依賴(lài)腸道炎癥緩解，具有獨立性。
圖1 SP改善DSS誘導小鼠的結腸炎癥狀及焦慮樣行為
SP可減輕DSS誘導小鼠的海馬損傷及神經(jīng)炎癥
海馬損傷可影響情緒調節中樞的功能，進(jìn)而導致抑郁和焦慮等精神障礙。通過(guò)組織學(xué)染色、細胞標記與細胞因子檢測，探究SPSP在減輕神經(jīng)炎癥中的作用。
SP顯著(zhù)減輕DSS誘導的海馬體神經(jīng)元丟失、核固縮、尼氏小體減少等病理?yè)p傷，維持神經(jīng)元形態(tài)完整。檢測了海馬組織中炎癥介質(zhì)的濃度，結果顯示，SP顯著(zhù)降低了DSS處理小鼠海馬中IL-1β、?TNF?-α、IL-9、?IFN?-γ、IL-13、IL-6、G-CSF、GM-CSF、?MIP?-1β和IL-12P70的水平，但提高了IL-4、IL-5和IL-10的水平，結果表明，SP通過(guò)調節促炎細胞因子與抗炎因子之間的平衡，減輕了DSS誘導的海馬神經(jīng)炎癥。
為探究SP對小膠質(zhì)細胞/星形膠質(zhì)細胞的影響，統計了各組海馬區這兩種細胞的數量。發(fā)現SP減少DSS誘導的Iba-1陽(yáng)性小膠質(zhì)細胞數量（抑制小膠質(zhì)細胞活化），增加GFAP陽(yáng)性星形膠質(zhì)細胞數量（防止星形膠質(zhì)細胞丟失）；Western?blot證實(shí)SP降低M1型小膠質(zhì)細胞標志物iNOS的表達，上調星形膠質(zhì)細胞標志物GFAP的表達。合理推斷，SP通過(guò)減輕結腸炎小鼠海馬區的病理?yè)p傷和神經(jīng)炎癥，改善了其焦慮樣行為，這可能與抑制小膠質(zhì)細胞向M1表型極化及防止星形膠質(zhì)細胞丟失有關(guān)。
圖2 SP減輕DSS誘導小鼠的海馬損傷及神經(jīng)炎癥反應
SP改善DSS誘導小鼠腸道菌群失調并改變微生物組功能
探究SP是否通過(guò)腸道菌群發(fā)揮作用，通過(guò)16S?rRNA測序分析SP對DSS誘導菌群失調的調控作用，結合PICRUSt2預測菌群代謝功能。
與DSS誘導組相比，SP對腸道菌群豐富度和多樣性均未產(chǎn)生顯著(zhù)影響，PCoA分析顯示CON組、DSS組和DSS+SP組之間存在顯著(zhù)差異，表明細菌群落結構存在顯著(zhù)差異。在門(mén)水平，SP?顯著(zhù)提高厚壁菌門(mén)（Firmicutes）相對豐度，降低擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）和變形菌門(mén)（Proteobacteria）豐度。在科水平，SP?增加毛螺菌科（Lachnospiraceae）、鼠桿菌科（Muribaculaceae）豐度，降低擬桿菌科（Bacteroidaceae）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）豐度。在屬水平，DSS+SP組中擬桿菌屬（Bacteroides）和擬桿菌亞屬（Alistipes）的相對豐度降低，而unclassified_Lachnospiraceae、unclassified_Muribaculaceae和?Lachnospiraceae_NK4A136_group的相對豐度上調。PICRUSt2預測顯示，SP顯著(zhù)激活肌醇磷酸代謝、膽汁分泌、NOD?樣受體信號通路等功能模塊，抑制戊糖磷酸途徑、生物膜形成等DSS誘導的異常功能模塊。
圖3 SP可改善DSS誘導小鼠的腸道菌群失調并改變微生物組功能
SP通過(guò)調節腸道菌群預防DSS誘導的腸道損傷及焦慮樣障礙
為驗證腸道菌群是否為SP發(fā)揮作用的必需環(huán)節，進(jìn)行了抗生素耗竭實(shí)驗驗證。ABX處理14天成功構建偽無(wú)菌小鼠模型后，SP對DSS誘導的結腸炎癥狀（DAI、體重、結腸長(cháng)度、腸道結構）和焦慮樣行為的改善作用顯著(zhù)減弱，表明SP的保護作用依賴(lài)腸道菌群。
同時(shí)進(jìn)行了糞便微生物移植（FMT）實(shí)驗驗證，FMT-DSS+SP組表現出更輕的體重下降、更低的DAI、緩解結腸縮短以及降低的脾臟/體重比，腸道黏膜損傷減輕，杯狀細胞數量增加，TNF-α、IL-6等促炎因子水平降低，MPO活性減弱。FMT-DSS+SP組小鼠海馬神經(jīng)元損傷也得到了緩解，促炎因子（TNF-α、IL-1β）mRNA表達降低，抗炎因子IL-4表達升高，小膠質(zhì)細胞M1表型（iNOS、CD80）表達降低，M2表型（CD206）表達升高，星形膠質(zhì)細胞GFAP表達上調。此外腸道菌群結構也與FMT-DSS組存在顯著(zhù)差異，厚壁菌門(mén)、未分類(lèi)鼠桿菌科等有益菌群豐度升高，擬桿菌屬等有害菌群豐度降低。
直接證實(shí)SP的保護作用依賴(lài)腸道菌群，排除SP直接穿過(guò)血腦屏障發(fā)揮作用的可能，明確菌群是SP調控腸腦軸的核心“中間人”。
圖4 SP以腸道微生物群依賴(lài)性方式預防DSS誘導的腸道損傷及焦慮樣障礙
圖5 FMT實(shí)驗表明SP通過(guò)調節腸道菌群減輕了DSS誘導的結腸炎和焦慮樣行為
SP通過(guò)調控腸道菌群影響海馬基因表達，涉及NF-κB和GABAergic/Ca2?信號通路
通過(guò)轉錄組測序分析FMT處理小鼠海馬體的差異表達基因，結合WB、免疫熒光染色，明確SP調控菌群后對腦內信號通路的影響。
RNA-seq顯示，FMT-DSS與FMT-CON組存在436個(gè)差異表達基因（DEGs），FMT-DSS+SP組與FMT-DSS組存在387個(gè)DEGs，其中158個(gè)基因為共同調控基因。KEGG分析顯示DSS組NF-κB通路激活，而SP通過(guò)菌群抑制其激活。qRT-PCR和Western?blot證實(shí)，SP降低海馬組織中IKBα、p65?的mRNA表達及p-p65、p-IKBα的蛋白表達；免疫熒光顯示SP減少小膠質(zhì)細胞中p-IKBα陽(yáng)性信號，抑制小膠質(zhì)細胞NF-κB通路激活。KEGG分析顯示SP激活神經(jīng)活性配體-受體相互作用和Ca2?信號通路。qRT-PCR顯示SP上調海馬組織中Gabra1、Gabra3、Gabrb2、Camk2d等基因表達；Western?blot證實(shí)SP增加GABA_A?Rα1、GABA_B?R2、GAD65（GABA?合成關(guān)鍵酶）和CaMKII（鈣濃度傳感器）的蛋白表達。
免疫熒光顯示SP增強星形膠質(zhì)細胞中GABA_A?Rα1和CaMKII的陽(yáng)性表達；流式分選細胞RNA-seq顯示，SP抑制小膠質(zhì)細胞中NF-κB通路相關(guān)基因富集，促進(jìn)星形膠質(zhì)細胞中GABA能突觸和鈣信號通路相關(guān)基因富集。
圖6 SP通過(guò)調節腸道微生物組影響海馬基因的表達
SP增強腸道微生物源性代謝物肌醇的富集
腸道菌群通過(guò)代謝物介導腸腦軸溝通，采用非靶向代謝組學(xué)分析DSS、DSS+SP、CON三組小鼠的結腸內容物代謝譜，篩選SP調控的關(guān)鍵代謝物。
PLS-DA分析顯示，三組代謝譜存在顯著(zhù)分離，DSS+SP組代謝表型更接近CON?組，表明SP可逆轉?DSS?誘導的代謝紊亂。共鑒定出395個(gè)差異代謝物，其中肌醇（inositol）是SP干預后升高最顯著(zhù)的代謝物之一，且富集于肌醇磷酸代謝、半乳糖代謝等通路。
Spearman相關(guān)性分析顯示，肌醇水平與有益菌群呈正相關(guān)，與結腸炎嚴重程度呈負相關(guān)，提示肌醇可能是菌群介導?SP?保護作用的關(guān)鍵?“信使分子”。
圖7 SP可增強腸道微生物群源代謝物肌醇的富集
肌醇給藥可改善DSS誘導的結腸炎及焦慮樣障礙
通過(guò)飲水給予DSS誘導的結腸炎小鼠2%肌醇干預，驗證肌醇是否能單獨模擬SP的雙向保護作用。
肌醇顯著(zhù)抑制DSS誘導的體重丟失和DAI升高，恢復結腸長(cháng)度，修復腸道上皮損傷，上調E-cadherin，降低結腸組織中IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表達。肌醇處理組在開(kāi)放場(chǎng)試驗中移動(dòng)距離、中央區域活動(dòng)增加，在高架十字迷宮中開(kāi)放臂停留時(shí)間和進(jìn)入次數增加，焦慮樣行為緩解。肌醇緩解?DSS?誘導的海馬神經(jīng)元核固縮和尼氏小體丟失，降低海馬組織中促炎因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）mRNA?表達，升高抗炎因子IL-10表達；減少I(mǎi)ba-1陽(yáng)性小膠質(zhì)細胞數量，促進(jìn)GABA合成與受體表達，增加星形膠質(zhì)細胞及GAT1免疫陽(yáng)性表達。而單獨補充肌醇組與對照組（CON）相比，未觀(guān)察到明顯的腸道病理學(xué)和行為學(xué)改變。綜上，這些數據表明肌醇可能是SP發(fā)揮有益效應的關(guān)鍵候選代謝物。
圖8 腸道代謝物肌醇介導SP對DSS誘導小鼠結腸炎及焦慮行為的保護作用
肌醇在SP對DSS誘導小鼠焦慮樣行為的作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用
用肌醇合成抑制劑L-690330干預，驗證肌醇是否為SP發(fā)揮作用的必需分子；同時(shí)通過(guò)體外細胞實(shí)驗，驗證肌醇對小膠質(zhì)細胞與星形膠質(zhì)細胞的直接調控作用。
L-690330處理后，SP對DSS小鼠的抗焦慮作用及海馬體保護效應被顯著(zhù)逆轉。肌醇水平升高：FMT-DSS+SP組小鼠海馬體與血清中肌醇濃度顯著(zhù)高于FMT-DSS組，證實(shí)菌群衍生的肌醇可進(jìn)入血液循環(huán)并作用于大腦。體外細胞驗證：①?小膠質(zhì)細胞（BV-2）：100μM肌醇可顯著(zhù)降低LPS誘導的TNF-α、IL-1β、IL-6?等促炎因子表達，無(wú)細胞毒性；②?星形膠質(zhì)細胞（C8D1A）：肌醇可逆轉LPS誘導的GABA受體及CaMKII蛋白表達下調，激活GABAergic/Ca2?信號通路。
明確肌醇在SP調控通路中的“不可替代”地位，同時(shí)證實(shí)肌醇可直接調控神經(jīng)細胞功能，完善“菌群代謝物?–?腦”的調控鏈條。
圖9 肌醇在SP對DSS誘導小鼠焦慮樣行為的作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用
研究總結
SP通過(guò)調節腸道菌群結構，促進(jìn)有益菌群產(chǎn)生肌醇；肌醇進(jìn)入循環(huán)后作用于海馬體，一方面抑制小膠質(zhì)細胞NF-κB促炎通路，減輕神經(jīng)炎癥；另一方面激活星形膠質(zhì)細胞GABAergic/Ca2?信號通路，增強抗焦慮神經(jīng)傳導；最終實(shí)現對結腸炎的腸道保護與焦慮樣行為的神經(jīng)調節，形成“SP-腸道菌群-肌醇-海馬體”的完整調控軸。
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先睹為快：新一代植物廣靶定量代謝技術(shù)
本次發(fā)布的植物廣靶定量代謝組學(xué)產(chǎn)品并非簡(jiǎn)單技術(shù)迭代，百譜生物研發(fā)經(jīng)理李天運在發(fā)布會(huì )中詳細介紹了該產(chǎn)品是針對植物研究領(lǐng)域長(cháng)期存在的檢測靈敏度不足、數據庫不全、缺少內標定量三大痛點(diǎn)，形成多維度解決方案，獲與會(huì )專(zhuān)家高度認可。
高靈敏檢測：突破微量代謝物局限
針對傳統技術(shù)難以捕捉植物抗逆、品質(zhì)形成過(guò)程中微量代謝物的痛點(diǎn)，該產(chǎn)品采用 AB SCIEX QTRAP7500 高靈敏度檢測平臺，將檢測限降低一個(gè)數量級，可精準定量低豐度植物代謝物、特殊滲透調節物質(zhì)等低含量成分。即使是植物應對脅迫時(shí)微量積累的關(guān)鍵代謝物，也能被清晰捕捉。
數據庫完整性：高達7萬(wàn)種代謝物
代謝組研究的核心在于數據庫完整性，該產(chǎn)品將代謝物數據庫從傳統 “數千種” 擴容至 “數萬(wàn)種”，高達7萬(wàn)種，并補充標準品多維注釋信息，使代謝物鑒定準確率大幅提升，可有效避免 “漏檢關(guān)鍵成分”“誤判物質(zhì)種類(lèi)” 等問(wèn)題。
業(yè)內首發(fā)：同位素內標定量
業(yè)內首次在植物廣靶技術(shù)上加入同位素內標進(jìn)行定量分析平臺，擁有多種內標選擇，能根據不同的檢測需求和化合物特性，靈活挑選合適的內標，通過(guò)基質(zhì)內標線(xiàn)性和自研算法校正，可以得到更為準確的定量結果。
SCIEX中國市場(chǎng)開(kāi)發(fā)經(jīng)理方晶晶深度解讀了QTRAP7500設備技術(shù)的革新和優(yōu)勢，他認為：“代謝物的高通量、高靈敏和大隊列穩定性是未來(lái)代謝組發(fā)展的重要方向”。
企業(yè)戰略布局：推動(dòng)代謝組技術(shù)從實(shí)驗室走向田間
發(fā)布會(huì )上，百邁客生物創(chuàng )始人兼CEO鄭洪坤指出行業(yè)核心痛點(diǎn)：“測序能找植物的基因，但代謝組才懂它的‘品質(zhì)’！”他表示，現在代謝組在農業(yè)里的用處還沒(méi)完全打開(kāi)，未來(lái)要靠 “測序 + 代謝組” 組合拳，比如在育種環(huán)節通過(guò)基因篩選鎖定潛力品種，再以代謝組驗證維生素含量等品質(zhì)指標，提升育種效率與準確性。
百譜生物總經(jīng)理曹以襯公布近期發(fā)展規劃：這款植物廣靶定量代謝組學(xué)產(chǎn)品，是我們團隊潛心研發(fā)的核心成果——它打破了傳統技術(shù)在檢測靈敏度、數據庫覆蓋度上的局限，將成為植物研究領(lǐng)域的高效工具！未來(lái)我們將聯(lián)合頂尖設備廠(chǎng)商升級檢測平臺，進(jìn)一步提升超微量代謝物檢測能力，為農業(yè)科研創(chuàng )新、品種改良與產(chǎn)業(yè)升級提供關(guān)鍵支撐。
專(zhuān)家實(shí)踐驗證：技術(shù)落地解決產(chǎn)業(yè)實(shí)際難題
中國科學(xué)院海洋研究所段德麟研究員表示：傳統品質(zhì)研究像“看表面癥狀”，難知代謝層面連鎖反應；定量代謝組技術(shù)能幫我們“找病根”：可定量脅迫下小分子代謝物變化，整合數據構建完整代謝調控網(wǎng)絡(luò )，還能測低含量抗逆物質(zhì)提供精準標志物，培育口感更好、風(fēng)味更佳的品種。
北京大學(xué)現代農業(yè)研究院王旭教授以辣椒研究為例：“傳統依賴(lài)感官評價(jià)判斷辣椒辛辣度，精準度低且主觀(guān)性強。該技術(shù)可定量檢測辣椒素合成的多種中間產(chǎn)物，我們已通過(guò)其篩選出維生素C高含量的辣椒品種，推動(dòng)品質(zhì)育種升級?！?/p>
中國科學(xué)院海洋研究所張立濤副研究員認為：傳統方法研究微藻蝦青素合成途徑，僅能發(fā)現終產(chǎn)物變化，無(wú)法定位影響關(guān)鍵代謝物的中間途徑，尤其是強光、氮源等因素調控不同產(chǎn)物的分支途徑。植物廣靶定量代謝組學(xué)技術(shù)可精準識別終產(chǎn)物及其中間產(chǎn)物，為提升微藻中活性物質(zhì)合成提供了明確的方向。
北京大學(xué)現代農業(yè)研究院王旭教授（左二）、中國科學(xué)院海洋研究所段德麟研究員（右二）、中國科學(xué)院海洋研究所張立濤副研究員（右一）
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植物研究領(lǐng)域受限于檢測靈敏度不足、代謝物數據庫不全、缺乏精準內標定量等問(wèn)題，尤其是在非模式植物研究中，微量代謝物難以捕捉、關(guān)鍵成分易漏檢誤判、定量結果準確性不足等痛點(diǎn)，嚴重制約了研究效率與產(chǎn)業(yè)應用進(jìn)程。此次發(fā)布的植物廣靶定量代謝組學(xué)技術(shù)，針對性提出多維度解決方案。>>詳情
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植物代謝組研究伴隨著(zhù)分析技術(shù)的發(fā)展和對植物代謝認識的深入而逐步開(kāi)展。19世紀末，科學(xué)家開(kāi)始研究植物的化學(xué)成分及其藥理作用，這成為植物代謝組研究的雛形。
1998年，Steven Oliver 在一篇關(guān)于酵母功能基因組學(xué)的綜述文章中創(chuàng )造了 “metabolomics” 一詞。此后，世紀之交發(fā)表的多篇論文闡述了代謝物譜分析在植物代謝調控等研究中的應用潛力，這些研究主要采用非靶向分析方法，推動(dòng)了多元統計方法在植物和細胞功能研究中的廣泛應用。
2010年前后，植物代謝組學(xué)研究日趨成熟，高分辨質(zhì)譜技術(shù)、代謝組學(xué)成像技術(shù)和代謝組學(xué)定量分析技術(shù)等得到廣泛應用。
2023年，中國科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng )新中心李軒團隊構建了涵蓋苔蘚植物、石松植物、蕨類(lèi)植物、裸子植物和被子植物五大類(lèi)群的150多個(gè)植物物種的參考代謝組及其數據庫RefMetaPlant，為植物代謝及植物生理相關(guān)研究提供了關(guān)鍵支持，促進(jìn)了代謝組學(xué)領(lǐng)域的數據交流共享與合作。
量溯植物代謝·解碼植物生命
從種子萌發(fā)到果實(shí)成熟，植物每一步代謝活動(dòng)都暗藏“量化密碼”。植物代謝組是植物生長(cháng)發(fā)育、逆境響應及品質(zhì)形成的?“動(dòng)態(tài)檔案”，而定量分析則是解讀這份檔案的關(guān)鍵鑰匙。為此，由青島百譜生物科技有限公司、北京百邁客生物科技有限公司聯(lián)合主辦的“植物廣靶定量代謝組學(xué)發(fā)布會(huì )”，將于9月17日在山東青島隆重召開(kāi)。
發(fā)布會(huì )以“量溯代謝” 為核心，將系統揭示植物定量代謝組學(xué)在科學(xué)研究與農業(yè)產(chǎn)業(yè)中的雙重驅動(dòng)力。發(fā)布會(huì )將分享基于液相色譜-高分辨質(zhì)譜（LC-HRMS）等技術(shù)的植物代謝物定量方法創(chuàng )新，詳解如何實(shí)現對數千種初生代謝物（如糖、氨基酸）和次生代謝物（如黃酮、生物堿）的精準定量與動(dòng)態(tài)追蹤。
此外，本次發(fā)布會(huì )將匯聚來(lái)自全國的諸多杰出學(xué)者與專(zhuān)家，他們將以論壇交流的形式在此深入研討與溝通，共同促進(jìn)代謝組學(xué)在農業(yè)中的研究，為我國在該領(lǐng)域的科技進(jìn)步貢獻卓越的智慧和力量。
出席嘉賓
鄭洪坤：百邁客生物創(chuàng )始人兼CEO
曹以襯：青島百譜生物科技有限公司總經(jīng)理
段德麟：中國科學(xué)院海洋研究所研究員
王 ?旭：北京大學(xué)現代農業(yè)研究院研究員
張立濤：中國科學(xué)院海洋研究所副研究員
方晶晶：SCIEX中國，生命科學(xué)研究市場(chǎng)開(kāi)發(fā)經(jīng)理
李天運：青島百譜生物科技有限公司質(zhì)譜研發(fā)經(jīng)理
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文章標題：Acetyl-CoA metabolism maintains histone acetylation for syncytialization of human placental trophoblast stem cells
期刊名稱(chēng)：Cell Stem Cell
影響因子：19.8
合作單位：中國科學(xué)院動(dòng)物研究所
研究對象：人類(lèi)妊娠早期胎盤(pán)樣本和人類(lèi)滋養層干細胞(hTSCs)
研究方法：轉錄組、表觀(guān)組學(xué)和非靶向代謝組學(xué)等
百邁客生物為該研究提供了轉錄組和非靶向代謝組檢測和分析服務(wù)。
研究背景
在妊娠期間，胎盤(pán)是連接母體和胎兒的重要瞬時(shí)器官，不斷向胎兒輸送氧氣、營(yíng)養物質(zhì)和代謝物，維持胎兒的正常生長(cháng)發(fā)育。胎盤(pán)發(fā)育是一個(gè)復雜的過(guò)程，包括胚泡期單層胚滋養外胚層(TE)向致密、多核、多細胞和多層器官的轉變。在懷孕期間，胎盤(pán)和胎兒的營(yíng)養分配對胎兒和母親的健康至關(guān)重要。然而，胎盤(pán)滋養細胞中營(yíng)養物質(zhì)代謝和分配的調控機制尚不清楚。
實(shí)驗材料
從北京大學(xué)第三醫院(中國北京)治療性終止健康妊娠的6-8周的人正常絨毛組織收集。術(shù)后1小時(shí)內，將組織浸泡在冰凍的DMEM/F12培養基中，進(jìn)行原代細胞分離或組織固定。從新鮮人絨毛組織中分離到原代滋養細胞(CTBs和STBs)。將人絨毛組織倒搖3分鐘，通過(guò)100mm和38mm篩子，收集38mm篩子上殘留的STB。將殘留在100毫米屏幕上的絨毛組織浸泡在PBS中，修剪成2-3毫米的組織。然后，用0.25%的胰蛋白酶和DNase消化絨毛組織，在4℃，并通過(guò)75毫米篩子。離心收集細胞，在1.25%和2.5%牛血清白蛋白(BSA)中沉淀得到細胞滋養層細胞。
研究結果
1.組織學(xué)分析——糖酵解酶水平在合胞滋養細胞中顯著(zhù)降低
妊娠期間，STB是一種重要的胎盤(pán)滋養細胞，可介導代謝物交換，分泌多種激素，如人絨毛膜促性腺激素(hCG)、孕酮等。為了研究滋養細胞合胞過(guò)程中原代CTBs和STBs之間發(fā)生的代謝變化，該研究挖掘了之前人類(lèi)妊娠早期胎盤(pán)的單細胞RNA測序(RNA-seq)數據。結果發(fā)現，在RNA水平上，原代CTBs中糖代謝和TCA循環(huán)的多個(gè)關(guān)鍵酶的表達高于STB。
通過(guò)免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色在孕早期人類(lèi)胎盤(pán)絨毛組織中，證實(shí)了許多關(guān)鍵的糖酵解酶，包括己糖激酶2 (HK2)、磷酸果糖激酶、血小板型(PFKP)、磷酸果糖激酶、肝型(PFKL)和乳酸脫氫酶A (LDHA)，確實(shí)在CTBs中比體內STBs更廣泛地表達(圖1A)。通過(guò)實(shí)時(shí)qPCR和免疫印跡(圖1B)繪制關(guān)鍵代謝酶的變化。結果顯示，糖酵解酶，包括己糖激酶1 (HK1)、HK2、PFKP、PFKL、丙酮酸激酶M1 (PKM1)、LDHA和乳酸脫氫酶B (LDHB)， CTBs均顯著(zhù)高于STBs(圖1B和1C)。線(xiàn)粒體生物發(fā)生相關(guān)轉錄因子PGC1a和細胞色素氧化酶(COX) IV在STBs中高表達，而糖原代謝酶肝糖原磷酸化酶(PYGL)和糖原1 (GYG1)在CTBs中高于STBs(圖1C)，與糖原的周期性酸-希夫(PAS)染色一致(圖1A)。在主要調控糖酵解酶的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路中，CTBs中蛋白激酶B (AKT)、核糖體蛋白S6 (S6)和真核翻譯起始因子4E (4EBP1)的磷酸化水平顯著(zhù)高于STBs(圖1C左)。這些結果表明，糖酵解和糖原溶解的糖代謝途徑在合胞滋養細胞中顯著(zhù)減少，而OxPhos水平基本保持不變。
圖1-人類(lèi)原始CTBs和STBs的代謝狀態(tài)
2.代謝組學(xué)分析——滋養細胞合胞化伴隨著(zhù)代謝的重構
為了更詳細地驗證CTBs和STBs之間的代謝差異，對妊娠早期胎盤(pán)中的原代CTBs和STBs進(jìn)行了代謝組學(xué)分析(圖2A)。相關(guān)熱圖、主成分分析(PCA)圖和代謝物豐度熱圖顯示，CTBs和STBs之間的代謝物存在顯著(zhù)差異。CTBs中葡萄糖代謝相關(guān)代謝物豐度高，包括3-磷酸甘油酸(3-PG)、乳酸、丙酮酸、蘋(píng)果酸、a-酮戊二酸等。STBs中富含脂肪酸代謝和激素代謝相關(guān)產(chǎn)物，包括雌酮、膽固醇、亞油酸等(圖2B)。CTBs和STBs的前20位代謝物也有顯著(zhù)差異。代謝物MSEA集富集分析(圖2C)和KEGG代謝物分析顯示CTBs主要富集于葡萄糖代謝和氨基酸代謝，包括Warburg效應、色氨酸、甘氨酸和絲氨酸代謝、糖酵解等。相比之下，STBs主要富集脂肪酸代謝和類(lèi)固醇激素合成相關(guān)通路，包括α -亞麻酸和亞油酸代謝、雌酮代謝、花生四烯酸代謝、類(lèi)固醇生物合成等。
此外，將代謝組學(xué)結果與葡萄糖代謝的蛋白質(zhì)分析結果聯(lián)合分析(圖2D)。結果表明，CTBs和STBs代謝產(chǎn)物的變化與代謝酶蛋白的變化一致。CTBs的糖酵解代謝物、3-PG、丙酮酸和乳酸明顯高于STBs(圖2D)。CTBs中TCA循環(huán)中的檸檬酸、α-酮戊二酸和蘋(píng)果酸明顯高于STBs(圖2D)。相比之下，STBs體內類(lèi)固醇激素代謝的相關(guān)關(guān)鍵代謝物較高，這與STBs合成激素的特點(diǎn)相一致。綜上所述，CTBs和STBs之間的代謝程序存在明顯差異。在高度增殖和未分化的CTBs中，葡萄糖代謝和氨基酸代謝更為活躍，而在有絲分裂后和分化的STBs中，脂肪酸代謝和類(lèi)固醇激素代謝更為活躍。
圖2-人原代CTBs和STBs的非靶向代謝組學(xué)分析
3.代謝組分析——葡萄糖代謝的基礎水平是滋養細胞合胞的必要條件
根據代謝組學(xué)和蛋白組學(xué)分析結果，葡萄糖代謝水平在合胞后急劇下降到基礎水平。許多研究表明，葡萄糖代謝的變化對決定干細胞的命運和分化很重要，因此，研究推測糖代謝與滋養細胞合胞之間存在重要聯(lián)系。為了在體外微擾實(shí)驗中模擬滋養細胞的合胞過(guò)程，該研究使用了hTSC培養和融合分化系統。再次檢測hTSCs在中誘導合胞前和合胞過(guò)程中相關(guān)代謝酶的蛋白和RNA水平。糖酵解的結論與原代CTBs和STBs的結果基本一致。
為了探索葡萄糖代謝對滋養細胞合胞過(guò)程的功能影響，該研究分別在未分化的hTSCs(在滋養細胞干細胞(TS)培養基中培養4天，TS- d4)和分化的STB(在STB培養基中培養4天，STB- d4)中使用HK抑制劑2-脫氧葡萄糖(2-DG)和LDH抑制劑oxamate抑制糖酵解的上游和下游速率限制步驟(圖3A)。由于糖代謝降低與STB分化相關(guān)(圖1、2)，研究者最初假設糖酵解抑制應該促進(jìn)合胞化。但是結果發(fā)現，與未分化的hTSCs相比，僅保留基礎糖酵解水平的合胞hTSCs對糖酵解的減少比較敏感。
圖3-基礎糖酵解對于人類(lèi)TSCs的合胞轉化至關(guān)重要
4.代謝組分析——糖酵解代謝產(chǎn)物的較佳水平促進(jìn)滋養細胞合胞
接下來(lái)，該研究使用糖酵解的關(guān)鍵代謝物，包括葡萄糖、丙酮酸和醋酸酯(用于補充細胞內乙酰輔酶A)，來(lái)探索糖酵解代謝物對人滋養細胞合胞的影響。結果表明，隨著(zhù)葡萄糖濃度的增加，從5到18 mM，STB-D4細胞中HCGB以及SDC1、ERVFRD1、ERVW1、GCM1、PSG4和CYP19A1的表達逐漸增強，滋養細胞的合胞化程度逐漸增強(圖3D)。丙酮酸處理在未分化的hTSCs和正在合胞的hTSCs中導致了類(lèi)似的反應，即一定濃度范圍內（10 mM）的代謝物增加了滋養細胞的合胞 (圖3E)。同樣，在一定濃度范圍內，乙酸也顯著(zhù)促進(jìn)滋養細胞合胞(圖3F)，在超高濃度下，HCGB、GCM1、PSG4和CYP19A1被顯著(zhù)抑制(圖3)。特別指出，糖酵解藥物和中間體對HTSCs和STBs的合胞有特異性作用，但對未分化的htsc沒(méi)有特異性作用。因此，涉及STB特異性信號傳導，并且調節滋養層合胞化可能需要較佳水平的基礎糖酵解物質(zhì)。
圖4-糖酵解乙酰輔酶A是TSCs合胞所需的關(guān)鍵代謝物
5.代謝組分析——乙?；拇x調節對合胞作用至關(guān)重要
實(shí)驗表明，糖酵解產(chǎn)物顯著(zhù)抑制hTSCs的合胞，而最佳水平的乙酸促進(jìn)hTSCs的合胞。為了反向確定最關(guān)鍵的糖酵解代謝物，該研究探索了最下游的糖酵解代謝物乙酰輔酶A(由乙酸補充)是否可以挽救糖酵解抑制對合胞的影響。結果顯示，在糖酵解抑制的情況下，乙酸能顯著(zhù)恢復STB-D4中HCGB和SDC1的表達水平(圖4A-4C)。融合指數結果證實(shí)了合胞恢復以劑量依賴(lài)的方式(圖4D和4E)。然而，當乙酸濃度過(guò)度增加到50 mM時(shí)，STBs細胞形態(tài)發(fā)生異常，引發(fā)細胞死亡，HCGB和SDC1基因表達無(wú)法檢測(圖4A)。因此使用10mM醋酸鹽用于所有其他實(shí)驗。實(shí)驗顯示，低濃度20 mM的草酸鹽對活死染色、線(xiàn)粒體膜電位、總蛋白、ADP/ATP比率和NAD+/NADH比率的影響不顯著(zhù)或輕微，但通過(guò)靶向LC-MS/MS檢測，乙酰輔酶A顯著(zhù)降低。10 mM醋酸鹽可使其乙酰輔酶A水平恢復正常。這些結果表明，乙酰輔酶A可能對滋養細胞的合胞作用很重要。
有報道稱(chēng)，由于乙酰轉移酶具有較高的Km，細胞內乙酰輔酶a可以作為蛋白質(zhì)乙?；牡孜锊⒅苯诱{控蛋白質(zhì)乙?；?，從而直接影響細胞的命運。例如，組蛋白乙?；拇x調節對染色質(zhì)狀態(tài)轉變至關(guān)重要。為了廣泛調查蛋白質(zhì)乙?；淖兓?，該研究對乙酰賴(lài)氨酸進(jìn)行了免疫印跡特異性檢測。結果顯示，未分化hTSCs的乙酰賴(lài)氨酸水平對草酸鹽相對不敏感，對乙酸補充也不敏感，除了在- 55 kDa處可能代表乙酰微管蛋白的條帶(圖4F、4G)。相反，分化STBs的乙酰賴(lài)氨酸水平被草酸鹽顯著(zhù)降低，并被乙酸鹽顯著(zhù)恢復(圖4F和4G)。特別是，組蛋白(H3和H4, 10-15 kDa)乙?；瘜σ宜岜憩F出明顯的劑量依賴(lài)性反應。因此，該研究檢測了乙酸鹽和草酸鹽處理的TS-D4和STB-D4細胞中乙?；? h3和乙?；? h4k16的水平。結果顯示，草酸鹽對未分化hTSCs中H3和H4K16的乙?；接绊懖淮?，但顯著(zhù)抑制STB-D4中H3和H4K16的乙?；?圖4H、4I)。在草酸處理的細胞中分別添加5和10 mM乙酸時(shí)，H4K16乙?；皆趧┝恳蕾?lài)性反應中表現出最大的梯度，而H3乙?；?，包括H3K9/18/27乙?；?，在劑量依賴(lài)性反應中表現出較平緩的梯度(圖4H、4I和SGM – s5p)。
綜上所述，該研究表明，適當的乙酸濃度可以緩解糖酵解抑制對合胞的抑制。草酸鹽的糖酵解抑制降低了STBs糖酵解乙酰輔酶A的基礎產(chǎn)生，從而降低了滋養細胞合胞過(guò)程中組蛋白乙?；乃?。因此，適當補充乙酸可以恢復細胞內乙酰輔酶A的水平，從而恢復正常的蛋白質(zhì)乙?；?，特別是組蛋白H3和H4乙?；?，并恢復正常的滋養細胞合胞(圖4J)。因此，糖酵解乙酰輔酶A的基礎水平對于調節組蛋白乙?；蚳TSC合胞是至關(guān)重要的。
圖5-RNA-seq顯示糖酵解衍生的乙酰輔酶A是促進(jìn)滋養細胞合胞程序所必需的，在合胞過(guò)程中，低水平的糖酵解衍生的乙酰輔酶A會(huì )觸發(fā)滋養細胞的代謝和炎癥應激反應
6.轉錄組分析——RNA-seq顯示糖酵解乙酰輔酶A代謝是促進(jìn)滋養細胞合胞程序所必需的
為了進(jìn)一步表征乙酸如何在滋養細胞合胞過(guò)程中恢復糖酵解抑制的作用，作者對經(jīng)草酸和乙酸處理的TS-D4和STB-D4細胞進(jìn)行了RNA測序(N = 8個(gè)樣本)。相關(guān)熱圖分析和主成分分析顯示，經(jīng)草酸和乙酸處理的未分化hTSCs的基因表達變化無(wú)明顯變化(圖5A)。然而，對于正常的STB-D4 (STB_c)，草酸處理(STB_ox)導致轉錄組發(fā)生劇烈變化，而5和10 mM乙酸處理(STB_oa5, STB_oa10)逐漸使轉錄組恢復正常(圖5A)?；蚣患治?GSEA)進(jìn)一步證實(shí)未分化的hTSCs被富集用于糖酵解，而分化的STBs則被富集用于類(lèi)固醇激素基因(圖5B)。這些轉錄組結果再次強調了未分化的hTSCs對草酸或乙酸鹽不敏感，而分化的STBs對草酸抑制和乙酸鹽拯救高度敏感。
根據翻轉圖(圖5C)，被草酸 (STB_ox)特異性下調但被乙酸(STB_oa5或STB_oa10)逆轉的基因表現出強烈的劑量依賴(lài)性。合胞化相關(guān)基因，包括SDC1、CGB同源物、ERVW1、ERVFRD1和GCM1，在草酸抑制的STB-D4中以劑量依賴(lài)的方式被5和10 mM乙酸部分恢復(圖5D)。
火山圖顯示，在STB_ox中，CGB同源基因、ERVFRD1、ERVW1、SDC1、CYP17A1等合胞程序基因顯著(zhù)降低，而JUN、腫瘤壞死因子(TNF)、FAS、TP53等炎癥相關(guān)基因顯著(zhù)上調。相反，補充乙酸導致SDC1、CGB同源物、ESRRB、CYP17A1、PSG11等合胞程序基因上調，表明STBs功能逐漸恢復。
接下來(lái)，研究者使用短時(shí)間序列表達挖掘(STEM)技術(shù)分析具有相同趨勢的基因簇。圖中顯示了胎盤(pán)cAMP信號、激素代謝和ERK/MAPK通路中一些已知的基因(圖5E)。
此外，GSEA進(jìn)一步顯示，與未分化的HTSC (TS_c)相比，STB_c中特異性富集了糖皮質(zhì)激素、激素生物合成、抗菌肽和胺源性激素等四個(gè)基因集(圖5F)。此外，與單獨處理STB_ox的STB_c和STB_d4 (STB_oa5和STB_oa10)相比，這四個(gè)基因組在同時(shí)處理的STB_c和STB_d4中也顯著(zhù)富集。
綜上所述，這些結果表明糖酵解衍生的乙酰輔酶A對于滋養細胞合胞程序和STB核心功能的適當激活是必要的。與hTSC程序相比，研究發(fā)現整個(gè)STBs分化程序對糖酵解乙酰輔酶A代謝異常敏感。
7.轉錄組分析——滋養細胞感知葡萄糖衍生的乙酰輔酶A的缺乏，從而在合胞過(guò)程中觸發(fā)代謝和炎癥應激反應
該研究將被乙酸拯救并下調的基因定義為“下調”。該集合包括三個(gè)集群，U17(145個(gè)基因)、U20(614個(gè)基因)和U18(288個(gè)基因)。這些基因都與細胞損傷和炎癥應激反應有關(guān)。其中許多是眾所周知的抗氧化、自噬、線(xiàn)粒體、DNA損傷和NF-kB特征中的基因(圖5G)。
GSEA進(jìn)一步顯示，與STB_c相比，未分化的TS_c特異性地富集了hippop – yap /Taz-TEAD特征(圖5H)。這些結果表明，草酸阻斷了STB的合胞，而這種分化阻斷被乙酸修復。此外，與正常STB_c和經(jīng)草酸和乙酸(STB_oa5和STB_oa10)處理的STB-D4相比，涉及DNA損傷、白素-6 (IL-6)信號、炎癥反應和TNF信號的四種GSEA特征均在STB_ox中特異性富集(圖5I)。
綜上所述，在滋養細胞合胞過(guò)程中，葡萄糖衍生的乙酰輔酶A的基礎水平是防止代謝應激和炎癥應激反應所必需的。研究發(fā)現STBs在分化和合胞過(guò)程中對糖酵解乙酰輔酶A應激高度敏感，并引發(fā)炎癥反應。
8.表觀(guān)組分析——組蛋白H3K9/18/27和H4K16乙?；瘜ζ咸烟堑囊阴；{控敏感，直接調控合胞化和代謝基因
鑒于滋養細胞可以感知葡萄糖衍生的乙酰輔酶A的缺乏，從而終止合胞程序并觸發(fā)代謝應激誘導的炎癥反應信號，研究者研究了組蛋白乙?；欠窨赡苁沁@種現象背后的機制之一。該研究使用靶下切割和標記(CUT&Tag)技術(shù)，對TSCs、STB-D1、STB-D4、STB-D4ox和STB-D4-oa10樣品和acetyl-H3K9、acetyl-H3K18、acetyl-H3K27和acetyl-H4K16抗體的數據顯示，這四種組蛋白乙?；揎椩诤习^(guò)程中表現出明顯的變化。
此外，對于每個(gè)組蛋白修飾，在TSCs, STB-D1和STB-D4的基因啟動(dòng)子區域進(jìn)行了Venn交叉分析。僅在STB組中發(fā)現的基因(TS組中沒(méi)有)被定義為STBUP，表明這些基因啟動(dòng)子在合胞過(guò)程中具有相關(guān)的組蛋白乙?；揎?/strong>(圖6A-6D)。同樣，對STB-D4、STB-D4-ox和STB-D4-oa10進(jìn)行了Venn交叉分析。僅在STB-D4和STB-D4-oa10中發(fā)現的基因被定義為STBres，而在STB-D4-ox中沒(méi)有發(fā)現，這表明這些基因啟動(dòng)子具有由糖酵解乙酰輔酶A代謝調節的組蛋白修飾(圖6A-6D)。所有四種組蛋白乙?；腟TBUP組的交集被定義為STBUP-all。同樣，所有四種組蛋白乙?；腟TBres基團的交集(圖6E)被定義為STBres-all。
為了研究STBUP-al中哪些基因對合胞至關(guān)重要，該研究交叉了STBUP-all和STBres-all數據集。確定了2834個(gè)基因位點(diǎn)，其中TSS上的這四個(gè)組蛋白乙?；稽c(diǎn)都被乙酸拯救并與合胞有關(guān)(圖6E)，包括眾所周知的合胞標記SDC1、CGB和ERVFRD1(圖6I)。重要的是，已知CGB參與激素合成/分泌，與TSCs和STB-D1相比，在STB-D4中，CGB在其TSS啟動(dòng)子區域表現出顯著(zhù)的乙酰- h3k27(圖6I)。GO和KEGG通路分析顯示，這些基因主要參與有絲分裂控制、合胞起始和STB功能，包括MAPK通路、cAMP通路、胎盤(pán)發(fā)育、激素合成/分泌、糖、氨基酸和脂肪酸運輸(圖6G、6J-6L)。其中，已知CYP19A1參與激素合成/分泌，在STB-D4的TSS啟動(dòng)子區域顯示顯著(zhù)的乙酰- h3k27(圖6J)。胎盤(pán)發(fā)育的另一個(gè)關(guān)鍵基因GCM1在STB-D1和STB-D4的TSS啟動(dòng)子區域均顯示出顯著(zhù)的乙酰- h3k9(圖6K)。cAMP應答元件結合蛋白1 (CREB1)參與“cAMP應答元件結合”，在STB-D1和STB-D4的TSS啟動(dòng)子區域表現出顯著(zhù)的乙酰- h4k16(圖6L)。重要的是，草酸處理明顯導致所有這些基因的TSS啟動(dòng)子區域組蛋白乙?；@著(zhù)降低，而乙酸補充部分恢復了組蛋白乙?；?/strong>(圖6I-6L)。
為了探究被乙酸拯救的組蛋白乙?；欠褚矊е罗D錄拯救，該研究比較了來(lái)自CUT&Tag的STBres-all集與來(lái)自RNA-seq的拯救基因集(包括U5、U7和U8，共660個(gè)基因)。分析結果顯示，這兩個(gè)基因集共有323個(gè)基因(圖6F)，即表觀(guān)遺傳和轉錄獲救。對這些表觀(guān)遺傳和轉錄獲救的基因進(jìn)行GO和KEGG通路分析的結果與RNA-seq分析的結果相似，在cAMP和MAPK信號、激素合成/分泌以及其他合胞途徑中的跨膜物質(zhì)運輸中都有顯著(zhù)的富集(圖6H、6M、6N)。
值得注意的是，在“活性跨膜轉運體活性”途徑中，草酸處理后，SLC30A3在其TSS啟動(dòng)子區域乙?；鵫3k18顯著(zhù)降低，而乙酸補充能夠部分恢復其乙?；鵫3k18(圖6M)。在“類(lèi)固醇激素應答”途徑中，經(jīng)草酸鹽處理后，ESRRB在其TSS啟動(dòng)子區域乙酰h4k16顯著(zhù)降低，部分被醋酸鹽挽救(圖6N)。
綜上所述，由乙酰輔酶A調節的組蛋白乙?；瘜τ谧甜B細胞合胞程序和STB核心功能的適當激活是必要的。與TS細胞對草酸和乙酸不敏感相比，研究發(fā)現STB分化程序對乙酰輔酶A代謝異常敏感。
圖6-乙?；? h3k9、乙?；? h3k18、乙?；? h3k27和乙?；? h4k16在TSC合胞過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化
9.轉錄組和表觀(guān)組分析——體內短暫的糖酵解乙酰輔酶a缺乏會(huì )永久性地損害滋養細胞的合胞作用
人TSCs可以注射到免疫缺陷的NOD-SCID小鼠體內，以評估其體內分化潛力。因此，該研究使用這種異種移植模型來(lái)探索糖酵解乙酰輔酶A短暫缺乏對人滋養細胞體內合胞的永久表觀(guān)遺傳影響。
小鼠皮下注射對照hTSCs (TS-ctrl)、氨基甲酸酯處理hTSCs (TS-ox)和氨基甲酸酯和醋酸酯短暫處理hTSCs (TS-oa10)。隨意喂養NOD-SCID小鼠生長(cháng)7天后，檢測血清hCG，并對移植的滋養細胞進(jìn)行免疫熒光和免疫組織化學(xué)染色，以確定體內滋養細胞的合胞程度(圖7A)。然而，結果顯示STBs分泌到TS-ox小鼠血清中的hCG明顯低于TS – control小鼠(圖7B)。這與靶向數據一致，顯示在STB分化的第1天，乙酰輔酶A已經(jīng)開(kāi)始上升，轉錄和表觀(guān)基因組數據顯示，STB分化的許多標記已經(jīng)在第1天開(kāi)始上升。因此，滋養層細胞在分化24小時(shí)內就已經(jīng)進(jìn)入了STB的命運，在滋養層分化的這個(gè)時(shí)間點(diǎn)干擾糖酵解代謝可能對細胞命運產(chǎn)生不可逆的影響，但不影響細胞活力。
為了證明這一點(diǎn)，該研究對每個(gè)滋養細胞移植物進(jìn)行組織染色。用KRT7和CDH1鑒定滋養細胞，用SDC1和b-hCG鑒定哪些細胞是STB。結果顯示，TS- control小鼠的滋養細胞移植物在體內能夠正常分化并形成多核STB(圖7C、7D)。然而，TS-ox小鼠體內形成的多核STB較少，盡管草酸處理的細胞仍然可以存活并在免疫缺陷小鼠中生長(cháng)形成大的KRT7+/CDH1+移植物(圖7E, 7F)。
在TS-oa10小鼠中，多核STB的形成與TS – control小鼠相似，表明短暫的乙酸處理恢復了hTSCs的合胞能力(圖7G、7H)。此外，該研究計算了STB面積與移植物總面積的比值，結果表明，草酸處理的hTSCs在體內的合胞能力永久性降低。與TS -ox組相比，TS-oa10組經(jīng)短暫乙酸處理后，體內STBs面積完全恢復(圖7I和7J)。同時(shí)，與TS-ox組相比，STBs向TS-oa10小鼠血清中分泌的hCG也顯著(zhù)增加(圖7B)。
RNA-seq結果表明，糖酵解乙酰輔酶A缺乏引起體外STBs的促炎應激反應。因此，該研究檢查了它們在體內的炎癥狀態(tài)。結果顯示，與TS – control小鼠和TS-oa10小鼠相比，TS-ox小鼠滋養細胞移植物周?chē)懈嗟淖匀粴毎?NK)細胞(天然細胞毒性觸發(fā)受體1,NCR1)和巨噬細胞(F4/80, CD163)募集。這些結果表明，由短暫的糖酵解缺陷引起的異常的促炎滋養細胞命運可以通過(guò)醋酸處理永久地恢復。
鑒于人滋養細胞移植物在體內不再暴露于草酸或乙酸，研究結果表明，由表觀(guān)遺傳決定的STBs分化潛力可能會(huì )因糖酵解乙酰輔酶A代謝的短暫缺乏而永久中斷，由此產(chǎn)生的異常的促炎滋養細胞可以通過(guò)短暫的醋酸補充而在功能上得到恢復。
研究總結
該研究通過(guò)代謝組學(xué)、轉錄組學(xué)、蛋白組學(xué)和表觀(guān)組學(xué)等技術(shù)，使用人類(lèi)妊娠早期胎盤(pán)樣本和人類(lèi)滋養層干細胞(hTSCs)發(fā)現，葡萄糖代謝在hTSCs和細胞滋養層細胞中高度活躍，但在合胞過(guò)程中，葡萄糖代謝降低到基礎水平，仍然是補充乙酰輔酶A和分化潛力所必需的。補充乙酸可以通過(guò)補充乙酰輔酶A和維持組蛋白乙?；瘉?lái)挽救糖酵解缺乏的合胞滋養細胞融合，從而挽救合胞基因的激活。即使是短暫的糖酵解缺乏也會(huì )永久性地抑制分化潛能和促進(jìn)炎癥，在體內也可以通過(guò)短暫補充乙酸永久地挽救。這些結果表明，hTSCs在合胞過(guò)程中僅保留基礎糖酵解乙酰輔酶A代謝，通過(guò)營(yíng)養反應性組蛋白乙?；{節細胞命運，這對我們理解胎盤(pán)和胎兒營(yíng)養之間的平衡具有重要意義。
1. 當hTSCs和CTBs分化為STBs時(shí)，它們的糖酵解通量降低。
2. 分化的HTSC保留基礎糖酵解，對糖酵解缺乏變得敏感。
3. 分化的hTSCs通過(guò)組蛋白乙?；诤习^(guò)程中感知乙酰輔酶A。
4.短暫的糖酵解應激永久性地降低hTSCs的分化潛能。
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文章標題：Chromosome-scale genome, together with transcriptome and metabolome, provides insights into the evolution and anthocyanin biosynthesis of?Rubus rosaefolius Sm.?(Rosaceae)
期刊名稱(chēng)：Horticulture Research
影響因子：7.6
合作單位：凱里學(xué)院和貴州植物園
研究對象：薔薇科空心藨
研究方法：基因組、轉錄組和植物廣靶代謝組學(xué)等
百邁客生物為該研究提供了基因組、轉錄組和植物廣靶代謝組檢測和分析服務(wù)。
研究背景
薔薇屬(薔薇科)有12個(gè)亞屬，700余種，除南極洲外分布在世界各地。薔薇屬植物的組織，尤其是成熟的漿果，通常含有多種促進(jìn)健康的化合物(如花青素、酚酸和類(lèi)黃酮)和營(yíng)養物質(zhì)(如纖維素、維生素E和天然色素)。自古以來(lái)，它們就被用作藥物和水果。
空心藨(Rubus rosifolius Sm.)是一種天然生長(cháng)在東亞、東南亞、南亞、大洋洲、非洲和馬達加斯加的紅色覆盆子?？招乃懙闹?、葉、根長(cháng)期以來(lái)被用于止咳、祛風(fēng)、止血、濕。成熟的薔薇果實(shí)含有豐富的花青素、酚類(lèi)物質(zhì)、三萜、甾醇等生物活性成分。因此，它具有多種藥理作用，包括抗氧化、鎮痛、抗菌、防腐、抗增殖、抗癌、利尿、降壓等。此外，成熟的薔薇果實(shí)具有獨特的酸甜味道，顏色鮮艷，很有吸引力。綜上所述，薔薇是一種吸引人的野果，具有很高的商業(yè)價(jià)值，因此具有很大的馴化和栽培潛力。
實(shí)驗材料
該研究以貴州植物園覆盆子種質(zhì)苗圃種植的一株薔薇為研究對象，進(jìn)行了基因組、轉錄組和代謝組實(shí)驗。對幼葉進(jìn)行基因組DNA提取分析。幼葉、幼莖、幼根、花萼、花瓣、雄蕊和3個(gè)幼果，發(fā)育天數分別為5、8和11天，三種著(zhù)色漿果，分別發(fā)育14、17和19天，對發(fā)育21、23和25天的3個(gè)成熟果實(shí)進(jìn)行RNA提取，進(jìn)行轉錄組分析。同樣的漿果也被用來(lái)進(jìn)行植物廣靶代謝組分析。
研究結果
1.基因組分析——基因組草圖組裝與注釋
該研究首先構建并測序了空心藨的短讀文庫(350 bp)，獲得了59.76 Gb的數據和97.53%的合格reads (>Q20)。K-mer分析，估計空心藨基因組大小為220.50 Mb，重復率為33.31%，雜合度為1.64%。然后，構建空心藨長(cháng)讀文庫并進(jìn)行測序，組裝成241.76 Mb的基因組草圖，由141個(gè)連續序列(contigs)組成(N50 = 15.36 Mb)。最后，構建并測序了空心藨的Hi-C文庫，獲得了> 1.65億個(gè)讀對。
利用這些有效的互作讀對對初步的基因組草圖進(jìn)行校正，得到了總共221.95 Mb的最終草圖，包含138個(gè)contigs (N50 = 16.13 Mb)。這些contigs進(jìn)一步聚集成131個(gè)支架(N50 = 30.0 Mb)。70個(gè)支架共219.02 Mb，占總組裝序列的98.68%，占估計基因組大小的99.33%，錨定在7條假染色體上。其中，20個(gè)支架(211.23 Mb)的位置和方向被確定，占錨定序列的96.44%。通過(guò)blast of essential genes (CEG)數據庫和BUSCO數據庫來(lái)估計該草圖基因組的組裝完整性，共鑒定出458個(gè)CEG的456個(gè)同源物(99.56%)和1614個(gè)BUSCO的1590個(gè)同源物(98.51%)。這些結果表明，組裝的空心藨基因組草圖具有較高的完整性。綜合各組組或支架的組裝完整性、無(wú)間隙度、N50等指標，該研究組裝的草圖基因組超過(guò)了其他覆盆子物種。
從空心藨基因組組裝草圖中，通過(guò)從頭算預測、同源性預測和RNA-seq預測相結合，共鑒定出28067個(gè)蛋白編碼基因，在這些預測的基因中，1584個(gè)(98.14%)與BUSCOs(1614)同源，26173個(gè)(93.25%)可以被注釋為具有生物學(xué)或分子功能，這些帶注釋的轉座元件和蛋白質(zhì)編碼基因不均勻地分布在紅花的染色體上(圖1)。從紅花草圖基因組中鑒定了1500多個(gè)RNA基因，主要是rRNA和tRNA基因，以及一些假基因。
圖1-基因組分析
2.基因組分析——薔薇與其他9種植物的系統發(fā)育關(guān)系及基因家族分析
為了研究空心藨的進(jìn)化關(guān)系，該研究分析比較了玫瑰、黃連、鵝掌楸、水稻、擬南芥、月季、花薔薇、桃李、中國栗、西方栗的基因集數據。系統發(fā)育樹(shù)顯示，薔薇科出現在白堊紀，覆盆子出現在古近紀，空心藨和另一種紅覆盆子R. chingii在1728-3644萬(wàn)年前(mya)從最近的共同祖先分化而來(lái)，隨后空心藨的211個(gè)基因家族和36個(gè)基因家族分別擴張和收縮(圖2)，這些擴展家族中的基因主要富集于代謝途徑，如“DNA聚合酶”、“光合作用”、“晝夜節律”和“半乳糖代謝”。
圖2-基因組進(jìn)化樹(shù)分析
3.基因組分析——基因組共線(xiàn)性分析和重復事件分析
所有的植物都有一個(gè)或遠或近的共同祖先。通過(guò)共線(xiàn)性分析發(fā)現：在1號染色體的一端和其他6條染色體上，發(fā)現了完整且平行的同源物，但在1號染色體的另一端缺失了大同源塊(圖3a)。這些結果表明，空心藨和紅覆盆子之間沒(méi)有發(fā)生大的染色體變異，但在空心藨和紅覆盆子基因組草圖的組裝或注釋中隱藏了錯誤。該研究發(fā)現，空心藨和紅覆盆子之間所有染色體的共線(xiàn)性幾乎是完整的(圖3b)，這表明上述1號染色體的組裝或注釋錯誤可能在空心藨中沒(méi)有發(fā)生。當忽略單倍型中支架組裝方向的干擾時(shí)，1、2、3、5、7號染色體幾乎完全平行共線(xiàn)性，4號染色體可能發(fā)生較大反轉，6號染色體可能發(fā)生3次或更少的反轉(圖3b)。這些發(fā)現表明，隨著(zhù)親緣關(guān)系距離的增加，復雜染色體變異的數量增加。
全基因組復制(WGD)分析發(fā)現。薔薇科其他成員與西方薔薇科同屬的共同祖先曾發(fā)生過(guò)WGD事件。
圖3-共線(xiàn)性分析?
圖4-重復事件分析
4.代謝組分析——漿果中花青素及其積累動(dòng)態(tài)
已有研究表明，空心藨漿果中含有豐富的花青素，特別是矢車(chē)菊素和天竺葵素。該研究利用植物廣靶代謝組技術(shù)鑒定到1330種代謝物，包括121種氨基酸和衍生物、248種酚酸、241種黃酮類(lèi)、78種生物堿和151種萜類(lèi)和有機酸。在黃酮類(lèi)化合物中，有17種花青素在9種不同時(shí)期的漿果中檢測到，幼齡期(N1)、著(zhù)色期(N2)和成熟期(N3)分別有3個(gè)、3個(gè)和3個(gè)。在N1向N2(發(fā)育期)過(guò)渡期間，總花青素和大多數種類(lèi)花青素的濃度保持相對穩定，只有天竺葵素-3- O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-木糖苷和天竺葵素-3-O -(6’’- O -丙二?；?葡萄糖苷繼續增加(圖5)，N2 ~ N3(發(fā)育階段)5種花青素(天竺葵素-3-O- (6 ’’-O-乙?；?糖苷和芍藥色素-3-O-糖苷)濃度保持相對穩定，2種花青素(天竺葵素-3-O-蘆丁苷和飛燕草素- 3-O-(6’’-O-咖啡酰)糖苷)濃度略有下降，此外，總花青素和其他10種花青素均呈上升趨勢。8種(如天竺葵素-3- O -半乳糖苷和天竺葵素-3- O (6’’-O -乙?；?葡萄糖苷)略有增加，2種(天竺葵素-3- O -(6’’-O-丙二?；?葡萄糖苷)急劇增加(圖5)，這些結果表明，空心藨花青素的產(chǎn)生主要發(fā)生在成熟階段，其主要貢獻物質(zhì)是紅色色素天竺葵素3-O -葡萄糖苷和天竺葵素3- O -(6’’ -O-丙二?；??葡萄糖苷。
圖5-不同時(shí)期漿果花青素含量差異顯著(zhù)
5.轉錄組分析——花青素生物合成相關(guān)的結構基因
轉錄組共鑒定出23997個(gè)基因在空心藨果實(shí)中不同水平表達。根據KEGG注釋?zhuān)茶b定出11個(gè)結構基因，其中花青素3-O-葡萄糖基轉移酶(RrBZ1)基因6個(gè)，分屬于5個(gè)家族，2個(gè)花青素3-O-葡萄糖苷2’’-O-木糖基轉移酶(RrUGT79B1)基因屬于一個(gè)家族，1個(gè)花青素3- O-葡萄糖苷5-O-葡萄糖基轉移酶(RrUGT75C1)基因和2個(gè)花青素3-O-葡萄糖苷6’-O-?；D移酶(Rr3AT)基因屬于兩個(gè)家族，參與了“花青素生物合成”途徑。此外，該研究還鑒定出22個(gè)結構基因，其中查爾酮異構酶(RrCHI)基因10個(gè)，屬于6個(gè)家族，5個(gè)查爾酮合成酶(RrCHS)基因，屬于4個(gè)家族，4個(gè)雙功能flavanol 4-還原酶/flavanone 4-還原酶(RrDFR)基因，分屬于3個(gè)家族，一個(gè)類(lèi)黃酮3’-單加氧酶(RrCYP75B1)基因，一個(gè)柚皮素3-雙加氧酶(RrF3H)基因，和一個(gè)花青素合成酶(RrANS)基因，參與“類(lèi)黃酮生物合成”，在花青素生物合成中起著(zhù)至關(guān)重要的上游作用。在這33個(gè)結構基因中，Rro07G000520.1 (RrBZ1)、Rro04G036130.1 (RrBZ1)、Rro01G021400.1 (RrF3H)、Rro07G031240.1 (RrDFR)、Rro04G035990.1 (RrCHS)、Rro04G036130.1 (RrCHS)、Rro07G006550.1 (RrCHI)和Rro05G014010.1 (RrANS)在漿果組織中表達量相對較高(圖6)。該研究推測這8個(gè)基因是參與空心藨花青素生物合成的主要基因。共有33個(gè)結構基因在空心藨的花、葉和根組織中表達，但沒(méi)有一個(gè)在漿果中表達。這一發(fā)現表明，花青素代謝存在于空心藨的各個(gè)組織中，并不是單獨存在于果實(shí)中。
圖6-花青素生物合成相關(guān)結構基因的表達與調控
6.聯(lián)合分析——花青素生物合成的基因調控
為了探索空心藨紅漿果中花青素生物合成調控的分子機制，該研究對空心藨紅漿果幼齡期和成熟期的轉錄組和代謝組進(jìn)行了相關(guān)性分析。在成熟漿果中發(fā)現的主要花青素——芍藥苷-3-O-葡萄糖苷和芍藥苷-3-O-(6’’-O-丙二?；?葡萄糖苷被鑒定為顯著(zhù)差異積累代謝產(chǎn)物(DAMs)，其中11個(gè)結構基因被發(fā)現為差異表達基因(DEGs)。其中，Rro07G000520.1 (RrBZ1)、rro07g035990.1和rro07g036130.1 (RrCHS)、rro07g06550.1 (RrCHI)、rro07g021400.1 (RrF3H)、Rro07G031240.1 (RrDFR)和Rro05G014010.1 (RrANS)與芍藥苷-3-O-葡萄糖苷積累呈正相關(guān)，而Rro07g033620.1、Rro07g024760.1 (RrBZ1)、Rro07G009270.1 (RrUGT75C1)、Rro04G021540.1 (RrUGT79B1)與這兩種物質(zhì)呈負相關(guān)(圖6b)。編碼屬于MYB、bHLH、AP2、bZIP、NAC和TCP家族轉錄因子的幾個(gè)DEGs的表達與上述一個(gè)或多個(gè)結構基因和兩個(gè)DEGs呈顯著(zhù)正相關(guān)或負相關(guān)(圖6b)。這些發(fā)現表明轉錄因子廣泛參與了空心藨花青素生物合成的調控。通過(guò)蛋白-蛋白相互作用(PPI)分析，該研究發(fā)現Rro4G033620蛋白(RrBZ1)與三甲基鳥(niǎo)苷合成酶1 (RrTGS1)直接相互作用，Rro5G003920蛋白(RrBZ1)直接與鐵氧還蛋白C1 (RrFDX1)、CCAAT結合轉錄因子(RrNFYA)、谷氨酸合成酶1 (RrGLU1)和組蛋白樣轉錄因子(RrCBF/NF-Y)相互作用，Rro1G021400蛋白(RrF3H)直接與RrFDR和RrANR相互作用(圖6c)。上述結果表明，空心藨花青素的合成受RNA甲基化、結構基因編碼蛋白和轉錄因子的相互作用調控。
研究總結
該研究獲得了一個(gè)高質(zhì)量的染色體水平基因組草圖，包含35.7%的重復序列和28067個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因。追蹤了薔薇科譜系特異性WGD事件，產(chǎn)生5090個(gè)目前可檢測的dgps，其中大多數進(jìn)行了純化選擇?？招乃懗墒旃麑?shí)花青素的積累主要是由芍藥苷-3-O-葡萄糖苷和芍藥苷-3-O-(6’’-O-丙二?；?葡萄糖苷引起的。該研究發(fā)現了許多與花青素生物合成有關(guān)的結構基因，它們的表達可能受到轉錄因子和結構基因編碼的RNA甲基化和蛋白質(zhì)相互作用等遺傳機制的調控。研究結果可為空心藨及其他薔薇屬植物的定向馴化和育種提供參考。
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文章標題：Postharvest quality and metabolism changes of daylily flower buds treated with hydrogen sulfide during storage
期刊名稱(chēng)：Postharvest Biology and Technology
影響因子：7.0
發(fā)表單位：山西農業(yè)大學(xué)和湖南農業(yè)大學(xué)
研究對象：黃花菜
研究方法：生理指標、植物廣靶代謝組學(xué)等
百邁客生物為本研究提供了植物廣靶代謝組檢測和分析服務(wù)。
研究背景
在黃花菜中，花蕾是營(yíng)養物質(zhì)的良好來(lái)源，含有大量的生物活性化合物，但在收獲后會(huì )變質(zhì)，這限制了黃花菜的口感和消費者的滿(mǎn)意度。硫化氫(H2S)被認為是一種重要的氣體信號分子，可以延長(cháng)水果和蔬菜的采后新鮮度。先前有研究表明，H2S通過(guò)減輕脂質(zhì)過(guò)氧化和增加抗氧化酶活性來(lái)延長(cháng)黃花菜采后壽命。然而，目前對H2S延緩黃花菜衰老的研究還停留在生理層面。H2S在黃花菜花蕾采后貯藏中的作用機制有待進(jìn)一步研究。本研究旨在研究H2S對黃花菜采后品質(zhì)及貯藏過(guò)程中花蕾代謝變化的影響。
實(shí)驗材料
本研究選用黃花菜(萱草)“大同黃花”，產(chǎn)于中國山西省大同市云州區?；ɡ偈窃谏虡I(yè)成熟前采摘的。將剛采收的黃花菜花蕾在4℃預冷后，在4 h內立即運至實(shí)驗室?；ɡ兕伾?、形狀、大小均勻，無(wú)物理?yè)p傷，分為7組。將每組黃花菜芽(200 g)分別置于含有200 mL蒸餾水、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0、4.8 mM NaHS溶液(H2S供體)的干燥器中。干燥劑保存于4℃，相對濕度85% ~ 95%。測定了黃花菜的失重率、開(kāi)花率、腐爛率和良花率，初步評價(jià)了黃花菜的品質(zhì)。
采后黃花菜T組選擇最佳H2S處理濃度，對照(CK組)以蒸餾水處理。連續處理6 d，每24 h更換一次處理液。從第0 d開(kāi)始收集樣品進(jìn)行比較。蒸餾水處理的樣品記錄為CK0-6，H2S處理的樣品記錄為T(mén)1-6，每24 h一次。每次處理三次。CK0、CK6、T6進(jìn)行代謝組檢測。
研究結果
?1.生理分析——H2S抑制黃花菜貯藏過(guò)程中的失重、開(kāi)花和腐爛
黃花菜在貯藏過(guò)程中，由于呼吸和蒸騰作用，水分和營(yíng)養物質(zhì)不斷被消耗。結果表明，隨著(zhù)貯藏時(shí)間的延長(cháng)，CK組表現為嚴重失重，H2S處理緩解了黃花菜的失重，尤其是3.2 mM NaHS緩解效果最大。H2S處理能不同程度地延遲了黃花菜的開(kāi)花，并能能較好地維持黃花菜的品質(zhì)。
圖1-H2S處理呈劑量依賴(lài)性地延緩了黃花菜花蕾品質(zhì)退化
2.生理分析——H2S對黃花菜MDA和H2O2含量有抑制作用
對比3.2 mM NaHS處理和未處理的黃花菜MDA含量，結果顯示，貯藏6 d內，CK和H2S處理組MDA含量均持續升高。貯藏4 d后，H2S處理顯著(zhù)抑制了MDA含量的增加。H2S處理的黃花菜在貯藏過(guò)程中H2O2的產(chǎn)生被阻斷。
圖2- H2S對黃花菜貯藏期間氧化應激的影響
3.生理分析——H2S緩解了TP含量的下降，維持了黃花菜的抗氧化能力
在CK和H2S處理組中，TP含量均隨貯藏時(shí)間的延長(cháng)而下降。H2S處理減緩了TP含量的下降，且從第3 d開(kāi)始出現顯著(zhù)差異，說(shuō)明H2S起到了阻斷蛋白的作用。H2S還改變了黃花菜的抗氧化系統。在整個(gè)貯藏期內，H2S處理組采后黃花菜GSH含量顯著(zhù)高于CK組。黃花菜SOD活性呈下降趨勢，而H2S在第2 d開(kāi)始顯著(zhù)緩解了這種下降趨勢，維持在高于CK組的水平。CAT活動(dòng)結果表明，H2S處理組CAT活性活性顯著(zhù)高于對照。
圖3-H2S對0 ~ 6 d黃花菜營(yíng)養物質(zhì)及抗氧化系統的影響
4.代謝組分析——黃花菜貯藏過(guò)程中代謝物分析
為了進(jìn)一步研究H2S對黃花菜貯藏過(guò)程中品質(zhì)的調控機制，利用植物廣靶代謝組學(xué)方法分析了NaHS處理后黃花菜代謝產(chǎn)物的變化。共鑒定了910種代謝物，包括429種初級代謝物和481種次生代謝物，分別為氨基酸、糖和醇、有機酸、脂質(zhì)、核苷酸、維生素、萜類(lèi)、黃酮類(lèi)、生物堿、多酚、“酮類(lèi)、醛類(lèi)、酸類(lèi)”、苯丙素、類(lèi)固醇、醌類(lèi)、香豆素、木脂素和山酮。PCA分析顯示，CK0, CK6和T6三組在代謝水平上存在差異。
根據FC > 1、P < 0.05和VIP > 1的篩選標準，在CK0和CK6之間共鑒定出443個(gè)DAMs。其中，254種代謝物在CK0中上調，189種代謝物下調。這些DAMs代表了衰老黃花菜的主要成分變化，可分為17類(lèi)，包括230種初級代謝物和213種次級代謝物。包括56種氨基酸、10種脂類(lèi)、11種核苷酸、27種有機酸、28種糖和醇類(lèi)、5種維生素、23種生物堿、3種香豆素、16種黃酮類(lèi)、6種酮類(lèi)、醛類(lèi)、酸類(lèi)、4種苯丙素、5種多酚類(lèi)、2種醌類(lèi)、8種類(lèi)固醇、32種萜類(lèi)和18個(gè)其他類(lèi)。對于下調代謝物，鑒定了93種氨基酸(21種)、脂質(zhì)(22種)、核苷酸(7種)、有機酸(26種)、糖和醇(15種)、維生素(2種)的初級代謝物，以及96種生物堿(12種)、類(lèi)黃酮(16種)、酮類(lèi)、醛類(lèi)、酸類(lèi)(8種)、木脂素(1種)、苯丙素(7種)、多酚類(lèi)(8種)、醌類(lèi)(2種)、類(lèi)固醇(3種)、萜類(lèi)(23種)和其他(16種)的次級代謝物。KEGG富集分析表明，DAMs與氨基?；? tRNA生物合成、乙醛酸鹽和二羧酸鹽代謝、精氨酸生物合成、D -氨基酸代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝密切相關(guān)。
CK6和T6積累的差異代謝物表明H2S處理具有顯著(zhù)影響。在396個(gè)顯著(zhù)改變的DAMs中，152個(gè)上調，244個(gè)下調。氨基酸(66)，有機酸(47)，糖和醇(40)，脂質(zhì)(25)，核苷酸(21)和維生素(4)，萜類(lèi)(51)，生物堿(32)，類(lèi)黃酮(25)，酮類(lèi)，醛類(lèi)，酸類(lèi)(14)，苯丙素(12)，多酚(10)，類(lèi)固醇(9)，香豆素(5)，醌類(lèi)(4)，其他類(lèi)(31)。這些DAMs主要與甘油磷脂代謝、嘧啶代謝、戊糖、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝有關(guān)。
在之前的研究中，通過(guò)比較M6 (6 d采果)與M0 (0 d采果)和1-MCP(1-甲基環(huán)丙烯處理6 d采果)與M6積累的代謝物差異，發(fā)現了54種與李子果實(shí)成熟相關(guān)的常見(jiàn)代謝物。同樣，通過(guò)比較CK0與CK6、CK6與T6中的DAMs，共鑒定出303種重疊代謝物與黃花菜在儲存期間的成熟密切相關(guān)。為了進(jìn)一步研究H2S處理下黃花菜衰老的化學(xué)基礎和潛在機制，作者分析了CK0與CK6、CK6與T6對照組中這些常見(jiàn)DAMs的聚類(lèi)熱圖。這些DAMs顯著(zhù)富集在嘧啶代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、精氨酸生物合成、戊糖和葡萄糖酸鹽相互轉化。在儲存第6 d時(shí)，胞苷5′-單磷酸、富馬酸、羥基乙酸、2′-脫氧胞苷-5′-單磷酸含量顯著(zhù)下調，而H2S處理后其含量則上調，除胸苷和肌氨酸外，其余大部分DAMs經(jīng)H2S處理后均恢復正常。硫酸鹽、5′-單磷酸尿苷、l -精氨酸、l -瓜氨酸、n -乙酰鳥(niǎo)氨酸在CK0組和CK6組中下調，而在CK6組和T6組中則呈現相反的趨勢。酮戊二酸、d -阿拉伯糖、d -阿拉伯糖醇、d -葡萄糖醛酸、l -異蘇氨酸、l -阿拉伯糖醇、l -天冬氨酸、l -絲氨酸、l -蘇氨酸、l -酪氨酸、丙二酸、甲基丙二酸、口角酸、利比醇、d -絲氨酸、l -同型絲氨酸-1、l -色氨酸在CK0和CK6處理中呈上調趨勢，但在H2S處理下呈抑制趨勢。結果表明，H2S可通過(guò)調節代謝水平延緩黃花菜衰老。
圖4- H2S處理下黃花菜廣靶代謝組學(xué)分析
圖5- H2S處理下黃花菜代謝物的差異積累
圖6-影響黃花菜貯藏期品質(zhì)變化的主要因素的鑒定
研究總結
在本研究中，評價(jià)了H2S對維持采后黃花菜品質(zhì)的影響。結果表明，H2S作為一種抗氧化信號分子，抑制MDA和H2O2的積累，誘導蛋白質(zhì)和抗氧化GSH的積累以及抗氧化酶的活性，從而維持了黃花菜貯藏過(guò)程中的氧化還原平衡。利用廣靶代謝組學(xué)方法鑒定了采后黃花菜中代謝物，并分析了它們在H2S處理下的變化。共鑒定和量化了910種代謝物，包括不同的化合物類(lèi)別，包括429種初級代謝物和481種次級代謝物。差異積累的代謝物主要分布在氨基酸、有機酸、糖和醇類(lèi)、萜類(lèi)中。在貯藏6 d內，各種壩的相對含量發(fā)生變化，但經(jīng)H2S處理后則發(fā)生逆轉。在CK0與CK6、CK6與T6兩組間共發(fā)現303個(gè)共同DAMs。這些代謝物主要富集在嘧啶代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、精氨酸生物合成、戊糖和葡萄糖酸鹽相互轉化的KEGG途徑中。代謝組學(xué)分析顯示，黃花菜在儲存和H2S處理期間存在廣泛的代謝重編程。H2S處理是維持黃花菜貯藏品質(zhì)的一種很有前途的方法。該研究為進(jìn)一步探索H2S處理下黃花菜代謝產(chǎn)物與采后品質(zhì)之間的復雜相互作用提供了參考價(jià)值。
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文章標題：Metabolomics and transcriptomic profiles reveal membrane lipid metabolism being an important factor of sliced taro browning
期刊名稱(chēng)：Postharvest Biology and Technology
影響因子：7.0
合作單位：韶關(guān)學(xué)院和華南農業(yè)大學(xué)
研究對象：芋頭
研究方法：生理、轉錄組學(xué)、代謝組學(xué)等
百邁客生物為該研究提供了植物廣靶、轉錄組測序和分析服務(wù)。
研究背景
在飲食中加入更多的新鮮蔬菜可以帶來(lái)許多健康益處，包括降低對慢性疾病的易感性和減緩衰老過(guò)程。市場(chǎng)上根莖類(lèi)蔬菜切根產(chǎn)品的保質(zhì)期短，破壞了這些優(yōu)勢。切面褐變是限制切片蔬菜產(chǎn)品壽命的主要因素之一。因此，了解切片產(chǎn)品褐變背后的機制對于開(kāi)發(fā)創(chuàng )新技術(shù)至關(guān)重要，這些技術(shù)可以在儲存和消費過(guò)程中有效地保持這些產(chǎn)品的營(yíng)養價(jià)值和整體質(zhì)量。
實(shí)驗材料
本研究選用購自中國韶關(guān)的“冰瑯玉”品種(Colocasia esculenta)。用于調查的芋頭大小相似，從大約800克到1000克不等，沒(méi)有任何明顯的缺陷或機械損傷。這些選定的芋頭被迅速運送到實(shí)驗室，為了確保清潔，在削皮和切割之前，要用自來(lái)水沖洗掉芋頭球莖表面殘留的淤泥。然后，將芋頭削皮，切成約1厘米厚的薄片作進(jìn)一步實(shí)驗。首先用次氯酸鈉溶液(0.1 g/L)對芋頭切片進(jìn)行滅菌。隨后，將無(wú)菌芋頭片密封在聚乙烯袋中(0.02 mm厚，尺寸為20 × 30 cm) (Xiao et al, 2020)。最后，芋頭切片冷藏(4℃)， RH為90-95%，持續12天。樣品每隔2天采集一次，用于后續分析。在第0天(C0)、第6天(C6)和第12天(C12)獲得的樣本用于植物廣靶代謝組學(xué)和轉錄組學(xué)分析。
研究結果
1.生理分析——冷庫條件下芋頭片褐變評價(jià)
芋片切面顏色隨貯藏時(shí)間的變化如圖1A所示。切面L*值從0 d時(shí)的88.72下降到12 d時(shí)的80.36，冷藏12 d后L*值下降了9%(圖1A)。芋頭切片表面的a*、b*、△E和BI值在冷藏過(guò)程中也表現出類(lèi)似的變化趨勢(圖1B-E)。這些褐變指標隨著(zhù)貯藏時(shí)間的延長(cháng)而增加。冷藏12 d后，a*、b*、△E和BI值分別比0 d增加了582%、58%、725%和19%(圖1B-E)。宏觀(guān)褐變癥狀在第6天首次出現，并在隨后的儲存過(guò)程中逐漸加劇(圖1F)。綜上所述，這些結果表明，即使在低溫(4℃)條件下，切片芋頭在儲存過(guò)程中也會(huì )發(fā)生褐變。
為了闡明切片芋頭褐變的機制，研究人員分別在第0天、第6天和第12天對芋頭樣品進(jìn)行了轉錄組學(xué)和代謝組學(xué)分析。
圖1-4℃貯藏期間切片芋頭的褐變發(fā)展
2.代謝組分析——切片芋頭褐變過(guò)程代謝組學(xué)分析
為了比較芋頭切片褐變過(guò)程中三個(gè)階段代謝物組成的差異，研究通過(guò)植物廣靶代謝組學(xué)分析，總共成功鑒定了芋頭切片中的638種代謝物。PCA分析顯示，三個(gè)儲存點(diǎn)采集的芋頭樣品具有明顯的分離性(圖2A)。在C0 vs C6中，共鑒定出206個(gè)DAMs，其中99個(gè)DAMs的豐度增加，107個(gè)DAMs的豐度減少。C6 vs C12共197個(gè)DAMs，分別有84個(gè)DAMs豐度增加，113個(gè)DAMs豐度減少。C0 vs C12包括119個(gè)DAMs，分別有51個(gè)DAMs和68個(gè)DAMs顯示豐度增加和減少(圖2B)。這些結果表明，在褐變過(guò)程中，代謝物豐度的減少幅度更大。
韋恩圖分析評估每個(gè)差異分組特有和共有的DAMs (圖2C)。圖2D-F展示了每個(gè)比較組中豐度增加和減少的top20的DAMs。C6組中10個(gè)代謝物豐度升高，如2′-脫氧腺苷、3-O-對香豆?？鼘幩?、n -乙酰- l -蘇氨酸、松柏醛、9(10)-EpOME、6-O-咖啡酰丁醇、表肌醇、l -同型半胱氨酸、5-O-對香豆?？鼘幩?、異鼠李素。相反，琥珀酸酐、9-(阿拉伯糖基)次黃嘌呤、氨基丙酸、N6-(2-羥乙基)腺苷、2-(二甲氨基)鳥(niǎo)苷、芐基-(2 ‘-O-木糖基)葡萄糖苷、鳥(niǎo)苷、肌苷、D-甘露糖和肌苷5 ‘ -單磷酸在C6組中的豐度較低(圖2D)。
在C6和C12中，9(10)- epOME、n -乙酰- l-蘇氨酸、2 ‘ -脫氧腺苷、松木醛、2-亞麻油基甘油-1,3-二- O-葡萄糖苷、6- O -對咖啡?；芄?、5-O-對香豆?；鼘幩?、異鼠李素、反式- 4-羥基肉桂酸甲酯和3- O -對香豆?；鼘幩嵩贑12組中表現出更高的富集度。相反，9-(阿拉伯糖基)次黃嘌呤、酪氨酸、S-Aiiyl-L-半胱氨酸、8，11，14-二十烷三烯酸甲酯、L-蛋氨酸甲酯、LysoPC17:0、鳥(niǎo)苷、肉桂酸、11、14、17-二十碳三烯酸和黃嘌呤在C6組中具有更高的豐度(圖2E)。
在C0和C12中，9(10)- epOME、n -乙酰- L-蘇氨酸、2 ‘ -脫氧腺苷、5- O -對香豆?；鼘幩?、2-亞麻油基甘油-1,3-二- O -糖苷、松木醛、6- O -對咖啡?；芄?、異鼠李素、3-O-對香豆?；鼘幩岷头词?4-羥基肉桂酸甲酯在C12組中含量較高。相反，9-(阿拉伯糖基)次黃嘌呤、肌苷、S – aiiyl -L -半胱氨酸、8，11，14-二十烷三烯酸甲酯、L-蛋氨酸甲酯、LysoPC17:0、鳥(niǎo)苷、肉桂酸、11、14、17-二十碳三烯酸和黃嘌呤在C0組中表現出更高的豐度(圖2F)。
圖2-切片芋頭植物廣靶代謝組分析
3.代謝組分析——切片芋頭褐變過(guò)程中DAMs的積累模式
為進(jìn)一步分析代謝物在9個(gè)樣本的積累模式，該研究進(jìn)行了聚類(lèi)熱圖分析。結果顯示，隨著(zhù)貯藏時(shí)間的延長(cháng)，褐變程度逐漸增加，推測持續增加的DAMs可能有助于切片芋頭的褐變或促進(jìn)其褐變過(guò)程。因此，該研究關(guān)注分析在褐變過(guò)程中豐度持續上升的DAMs (圖3B-L)。確定了11個(gè)DAMs在褐變過(guò)程中豐度持續增加，如2-α-亞麻烯酰甘油、甘油亞油酸、(9Z,11E)-十八烯二烯酸、N-油基乙醇胺、γ-亞麻酸、1-亞麻油基甘油、2-亞麻油基甘油、N-α-乙?；? L-鳥(niǎo)氨酸、α-亞麻酸、9-羥基-10、12-十八烯二烯酸和1-α-亞麻烯酰甘油。值得注意的是，在這11個(gè)DAMs中，有10個(gè)是脂肪酸或脂質(zhì)衍生物。幾種褐變指標與這些水DAMs之間的相關(guān)系數非常高。這些結果表明，在切片芋頭中脂質(zhì)代謝與褐變發(fā)展之間存在潛在的聯(lián)系。
圖3-切片芋頭中差異代謝物(DAMs)的積累模式
4.轉錄組分析——冷藏芋頭切片褐變過(guò)程的轉錄組學(xué)分析
為了更好地了解基因表達的變化，該研究進(jìn)行比較轉錄組分析。結果顯示許多基因在芋褐變過(guò)程中表現出不同的表達譜。具體來(lái)說(shuō)，在C0和C6的比較中，鑒定出3103個(gè)表達上調的基因和1685個(gè)表達下調的基因。同樣，在C6和C12組的比較中，發(fā)現3021個(gè)DEGs上調，2350個(gè)DEGs下調。此外，與C0組相比，C12組有5108個(gè)基因的表達量更高(圖4A)。在褐變過(guò)程中發(fā)現了更多的上調基因，表明芋頭的基因表達發(fā)生顯著(zhù)的變化。有趣的是，當比較C0與C6、C6與C12、C0與C12之間的DEGs時(shí)，發(fā)現1396個(gè)DEGs重疊(圖4B)。
根據褐變過(guò)程中的表達模式，將DEGs分為6個(gè)簇。每個(gè)聚類(lèi)(從1到6)分別由1607、1293、533、1741、634和2470個(gè)度組成(圖4C)。KEGG富集分析顯示，簇1中有四個(gè)途徑的DEGs顯著(zhù)富集:α-亞麻酸代謝、生物素代謝、植物-病原體相互作用以及淀粉和蔗糖代謝(圖4D)。此外，集群2中的DEGs在α-亞麻酸代謝、植物-病原體相互作用以及倍半萜和三萜生物合成途徑中富集(圖4E)。
圖4-切片芋頭褐變過(guò)程中的轉錄組學(xué)分析
5.聯(lián)合分析——基因共表達網(wǎng)絡(luò )構建
為了進(jìn)一步研究脂質(zhì)代謝與冷藏芋頭切片褐變之間的關(guān)系，研究采用WGCNA分析進(jìn)行研究。如圖5A所示，鑒定出兩個(gè)與切片芋頭在冷藏期間褐變發(fā)育顯著(zhù)相關(guān)的模塊。藍色模塊中基因與褐變BI、a*、b*、△E 4項指標呈正相關(guān)，而綠松石模塊中基因與褐變指標呈負相關(guān)(圖5B)。此外，隨著(zhù)褐變的發(fā)展，藍色模塊中基因的表達量逐漸增加，而綠松石模塊中基因的表達量逐漸減少(圖5C)。此外，藍色和綠松石模塊中每個(gè)基因與褐變的相關(guān)性都很高(圖5D)，說(shuō)明這兩個(gè)模塊的基因與冷藏芋頭片的褐變發(fā)育高度相關(guān)。
切片芋頭的褐變與藍色模塊中的基因正相關(guān)，對該模塊中的基因進(jìn)行了KEGG富集分析。在top20個(gè)富集的KEGG通路中，泛素介導的蛋白水解、α-亞麻酸代謝和谷胱甘肽代謝是富集最顯著(zhù)的通路。尤其是α-亞麻酸代謝途徑和甘油脂代謝途徑中分別富集了14個(gè)和18個(gè)基因(圖5E)。這些結果為脂質(zhì)代謝參與切片芋頭褐變的事實(shí)提供了進(jìn)一步的線(xiàn)索。
圖5-WGCNA對模塊與性狀的相關(guān)性分析
6.基因驗證——參與亞麻酸代謝的DEGs的表達模式
為了驗證RNA-seq數據的質(zhì)量，研究檢測了亞麻酸代謝途徑中DEGs的表達模式。在切片芋頭褐變過(guò)程中，該途徑中的DEGs差異表達(圖6A)。在這些基因中，4個(gè)基因(taro_028466、029177、001379和new gene_1582)的表達量在第6天較0天下降(圖6A)。10個(gè)基因(taro_026230、017933、007794、026197、032526、040173、011856、050352以及new gene_27424和3563)的表達量在第6天出現了增加，隨后又出現了下降。然而，這些基因在第12天的表達水平仍然高于第0天(圖6A)。其余15個(gè)基因在褐變過(guò)程中表現出穩定的表達增加。這些結果再次證實(shí)了亞麻酸代謝參與了芋頭褐變過(guò)程。
作者選擇了5個(gè)DEGs進(jìn)行qRT-PCR分析(圖6B-F)。隨著(zhù)貯藏時(shí)間的延長(cháng)或褐變程度的惡化，這5個(gè)基因的表達量均呈上升趨勢。此外，通過(guò)RNA-seq和qRT-PCR分析確定的這些基因的總體表達模式高度一致(圖6B-F)，證實(shí)了轉錄組學(xué)數據的可靠性。
圖6-亞麻酸代謝途徑中DEGs的表達模式
7.基因驗證——在褐變過(guò)程中，膜脂過(guò)氧化作用加劇
上述結果表明，膜脂代謝可能在芋頭褐變過(guò)程中起一定作用。為了進(jìn)一步研究，評估了參與膜脂過(guò)氧化的關(guān)鍵DEGs的表達譜，如脂肪酶(LIP)和脂氧合酶(LOX)。三個(gè)差異表達的LIP基因在褐變過(guò)程中表達持續增加。LOX基因，除了8個(gè)LOX基因在褐變過(guò)程中逐漸增加，其他基因在褐變過(guò)程中表達先增加后下降 (圖7a)。這些結果表明，新鮮切割操作(如剝皮和切割)激活了芋頭的脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程。
丙二醛通常被認為是植物脂質(zhì)過(guò)氧化的生物標志物。為了監測切片芋頭褐變過(guò)程中膜脂過(guò)氧化情況，測定了LOX活性和MDA含量。隨著(zhù)時(shí)間的推移，LOX活性和MDA含量隨著(zhù)褐變繼續進(jìn)行逐漸升高 (圖7B, C)。這些結果表明，在褐變過(guò)程中，膜脂過(guò)氧化加劇。此外，相關(guān)分析顯示，LOX活性、MDA含量和其他褐變指標之間存在很強的相關(guān)性?(圖7D)。這些結果進(jìn)一步支持了膜脂過(guò)氧化和/或代謝參與芋頭褐變。
圖7-膜脂過(guò)氧化的評價(jià)
研究總結
切面褐變的發(fā)生是鮮切行業(yè)中切片芋頭生產(chǎn)和商業(yè)化的一個(gè)重要障礙。代謝組學(xué)分析顯示，在芋頭褐變過(guò)程中，亞麻酸及其衍生物以及氫過(guò)氧化物的含量增加，表明發(fā)生了膜脂降解。RNA-seq分析顯示，參與褐變過(guò)程的DEGs富集于α-亞麻酸代謝途徑。WGCNA分析得到了兩個(gè)與芋頭褐變密切相關(guān)的模塊，其中藍色模塊的基因與BI呈正相關(guān)，強化了膜脂代謝與芋頭褐變之間的聯(lián)系。隨著(zhù)芋頭褐變的進(jìn)行，LOX基因的表達和蛋白活性以及MDA的水平增加，表明膜脂過(guò)氧化促進(jìn)了切片芋頭褐變?？傊?，該研究結果強調了膜脂代謝在切片芋頭褐變中的重要性。這項研究通過(guò)轉錄組和植物廣靶代謝組分析全面研究了芋頭褐變的機制。
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合作單位：丹麥奧胡斯大學(xué)
文章標題：Metabolic Communication by SGLT2 Inhibition
期刊名稱(chēng)：Circulation
影響因子：37.8
研究對象：小鼠、臨床隊列
測序技術(shù)：宏基因組測序、代謝組檢測。
百邁客生物為該研究提供了宏基因組測序服務(wù)。
研究背景
鈉-葡萄糖協(xié)同轉運蛋白2（SGLT2）主要在腎臟近曲小管S1段表達，負責對葡萄糖進(jìn)行定量重吸收。SGLT2 抑制劑（SGLT2i）是治療高血糖的有效療法，在2型糖尿病患者中，還可以保護心臟和腎臟免于衰竭。SGLT2i被認為具有許多作用和多效機制，涵蓋增強生酮和類(lèi)禁食代謝反應、腎臟和全身血流動(dòng)力學(xué)效應。然而，目前還未有研究闡明SGLT2i保護心血管和腎臟的關(guān)鍵機制，該機制對于心血管和腎臟保護至關(guān)重要。
丹麥奧胡斯大學(xué)學(xué)者在Circulation雜志上發(fā)表題為“Metabolic Communication by SGLT2 Inhibition“研究論文，研究團隊使用Akita小鼠模型和臨床隊列樣品，通過(guò)整合宏基因組、代謝組、蛋白組等多組學(xué)數據，確定了SGLT2i對腎臟、心臟、血管和其他器官的幾種SGLT2依賴(lài)性效應和脫靶效應，通過(guò)重構腎臟代謝物轉運和全身代謝通訊，發(fā)揮心腎保護作用。提供了關(guān)于SGLT2相互作用因子和SGLT2i依賴(lài)性蛋白質(zhì)組、代謝組、磷酸化蛋白質(zhì)組和宏蛋白質(zhì)組的新見(jiàn)解，從而為SGLT2i新型和早期機制靶標提供了潛在的路線(xiàn)，促進(jìn)代謝藥物的開(kāi)發(fā)。
材料方法
小鼠SGLT2i處理
19 只 8 周齡 C57BL/6J 雄性小鼠和 16 只糖尿病 C56BL/6-Ins2Akita/J 雄性小鼠，然后給予WD4周，WD后1周添加達格列凈或驅避WD飲食（vehicle；WT，n=9；Akita，n=8）。
組學(xué)技術(shù)
盲腸糞便宏基因組學(xué)和宏蛋白質(zhì)組學(xué)
腎組織、尿液、血漿非靶向代謝組
腎臟、肝臟、心臟、肌肉和白色脂肪組織蛋白質(zhì)組
研究結果
1、綜合組學(xué)方法發(fā)現和翻譯策略概述
該研究旨在闡明SGLT2i的生理機制。作者假設大量的代謝器官通訊是對SGLT2i的反應而發(fā)生的，因此選擇了綜合組學(xué)方法。對非糖尿病小鼠的所有主要代謝器官、生物體液和腸道微生物群以及Akita小鼠單純性高血糖的早期階段進(jìn)行了綜合代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析，Akita鼠是1型糖尿病的遺傳小鼠模型，長(cháng)期SGLT2i處理對其有改善作用（圖1A 和1B）。研究短期暴露于SGLT2i 1周，目的是確定主要代謝效應和可能建立保護作用的代謝通訊，而不是研究長(cháng)期治療后器官功能改善的后果。選擇高脂肪西方飲食（WD）是為了模仿西方生活方式的代謝環(huán)境。選擇達格列凈是因為其對患有和不患有糖尿病的患者具有心臟保護和腎臟保護特性。作者通過(guò)研究分析發(fā)現了一些意想不到的代謝信號（圖1C）。在后續研究中，將人腸道微生物培養物暴露于SGLT2i，使用SGLT2敲除 (KO) 小鼠來(lái)探測SGLT2i的脫靶效應，并在人腎、患者血漿和人誘導多能干細胞 (hiPSC) 中進(jìn)行翻譯驗證。同時(shí)在人腎、患者血漿和人誘導多能干細胞 （hiPSC）中進(jìn)行驗證（圖1D）。所得數據提供了關(guān)于SGLT2相互作用因子和SGLT2i依賴(lài)性蛋白質(zhì)組、代謝組、磷酸化蛋白質(zhì)組和元蛋白質(zhì)組的新見(jiàn)解，從而揭示了SGLT2i的下游通路，這也為代謝性疾病藥物的開(kāi)發(fā)提供了新思路。
圖1-研究設計和表型概述
2、匹配綜合有機組學(xué)發(fā)現和翻譯策略概述
使用達格列凈或溶劑對照一周后，對同一動(dòng)物的主要代謝器官的蛋白質(zhì)組學(xué)、磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)和宏蛋白質(zhì)組學(xué)方法進(jìn)行了深度多組學(xué)分析（圖1A和1B）。結果表明，達格列凈可降低Akita小鼠的血漿葡萄糖水平，但不會(huì )降低非糖尿病WT小鼠的血漿葡萄糖水平。達格列凈在WT小鼠中誘導糖尿，但在A(yíng)kita小鼠中沒(méi)有觀(guān)察到明顯的進(jìn)一步增加（圖S1A）。通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)檢測，在腎臟、肝臟、心臟、肌肉和白色脂肪組織中總共鑒定到9501個(gè)蛋白質(zhì)（8421個(gè)基因）和10744個(gè)磷酸化位點(diǎn)。其中，大多數SGLT2i引起的顯著(zhù)變化是在腎臟中觀(guān)察到的。
3、SGLT2抑制對腎臟蛋白質(zhì)組的重新配置
定量了腎皮質(zhì)中的6676種蛋白質(zhì)，其中在WT組鑒定到6107種蛋白質(zhì)，Akita小鼠鑒定到6207種蛋白質(zhì)。分析表明，SGLT2i對腎臟蛋白質(zhì)組的影響比糖尿病小鼠更強：在WT小鼠中，SGLT2i增加了455種蛋白質(zhì)，減少了485種蛋白質(zhì)(圖2A)。SGLT2i治療糖尿病小鼠的蛋白質(zhì)變化較少(29個(gè)增加，53個(gè)減少)。兩組小鼠腎臟線(xiàn)粒體蛋白豐度均有顯著(zhù)變化，但只有WT組小鼠體內線(xiàn)粒體膜蛋白顯著(zhù)上調(圖S2A)。此外，只有WT小鼠對SGLT2i有反應，腎臟頂端或基側膜上的蛋白質(zhì)(圖2B)或參與mRNA剪接的蛋白質(zhì)下調。在WT小鼠中觀(guān)察到的更強烈的變化之后，GO富集分析表明，跨各種功能相互連接的蛋白質(zhì)的跨膜轉運發(fā)生了一致的變化，大多數轉運蛋白在WT小鼠中被SGLT2i下調。
圖2-綜合蛋白質(zhì)組/相互作用組分析表明SGLT2i對腎臟代謝產(chǎn)物轉運的廣泛重塑
4、SGLT2i降低血漿腸源性有機陰離子(尿毒癥毒素)水平，盡管腎臟分泌轉運蛋白表達降低
為了確定除了葡萄糖之外的其他代謝信號通路是否影響了整體代謝譜，作者在選定的器官和生物體液中進(jìn)行了非靶向代謝組學(xué)分析，總共有186種代謝物發(fā)生了顯著(zhù)變化（所有器官總計322種）。作者發(fā)現SGLT2i主要影響尿液和血漿中代謝物的豐度，并且與糖尿病小鼠相比，非糖尿病小鼠受影響的分子多樣性更廣泛（圖3A）。
SGLT2抑制劑（SGLT2i）改變了腎蛋白質(zhì)組和磷酸蛋白質(zhì)組，同時(shí)調控其他代謝物轉運蛋白。其抑制作用引起了血漿和尿液代謝物的顯著(zhù)變化。因此，研究者提出腎蛋白質(zhì)組的重編程可能部分解釋了觀(guān)察到的代謝物變化。文章中指出了可能影響體液循環(huán)代謝物組成的多個(gè)過(guò)程，包括尿液排泄的改變（圖3B）。在WT小鼠中，SGLT2i在腎臟中減少了27種SLC的表達。結合這些結果和尿液代謝譜，表明了SGLT2i可能通過(guò)影響其他器官的代謝物組成，從而導致尿液中代謝物的變化（圖3C）。
接下來(lái)，作者分析了血漿和尿液中代謝物的含量，這些代謝物可以反映對腎臟轉運的主要影響。正如預期的那樣，葡萄糖和多種其他糖代謝物的血漿：尿液比率下降（圖3D），可能是因為腎小管重吸收減少。血漿：尿液比率增加的代謝物是賴(lài)氨酸代謝物，包括二氨基庚二酸、三甲基賴(lài)氨酸、哌可酸和氨基己二酸，一種針對小鼠模型中肥胖和糖尿病的保護性代謝物。許多響應SGLT2i而增加血漿：尿液比率的化合物是近端腎小管有機陰離子轉運蛋白OAT1的底物（圖3D）：其中包括乙酰半胱氨酸、瓜氨酸、葡萄糖酸鹽和蛋氨酸， 表明這些化合物的腎臟分泌可能會(huì )減少。蛋白質(zhì)組分析結果證實(shí)了這一點(diǎn)，即SGLT2i降低了WT中OAT1和OAT3的表達，腎膜組分的免疫印跡分析證實(shí)了這一點(diǎn)（圖3E）。與此同時(shí)，觀(guān)察到SGLT2i降低了所謂的滯留毒素或尿毒癥毒素的血漿水平（圖3A）。為了證實(shí)這一發(fā)現，對已知在腎臟疾病中保留且主要由腸道微生物組產(chǎn)生的血清代謝物進(jìn)行了針對性分析。SGLT2i減少了 WT 小鼠血漿中的許多尿毒癥毒素，包括PCL、ILA、鄰氨基苯甲酸、香草酸和3-吲哚基硫酸鹽（圖3F）。在獨立的非糖尿病動(dòng)物模型（高血壓Dahl SS大鼠）中，SGLT2i 同樣顯著(zhù)降低了PCL硫酸鹽和ILA：尿液比率（圖S4E）。如前所述，這不能通過(guò)腎尿毒癥毒素 (OAT1/OAT3) 分泌能力的下調來(lái)解釋?zhuān)⑶冶砻鱏GLT2i改變了這些化合物的形成。
圖 3-非靶向代謝組分析揭示了SGLT2i誘導的氨基酸和有機陰離子代謝變化
5、SGLT2i重組尿毒癥毒素氨基酸腸道菌群發(fā)酵
許多尿毒癥毒素是由菌群產(chǎn)生的，SGLT2i改變尿毒癥毒素的代謝物，主要來(lái)自苯丙氨酸和色氨酸。因此，作者假設SGLT2i影響菌群，從而改變這些代謝物的產(chǎn)生。為了檢驗這一假設，使用宏基因組輔助宏蛋白質(zhì)組學(xué)分析了匹配的盲腸微生物組（圖 S6A）。通過(guò)宏基因組學(xué)總共發(fā)現了6899個(gè)物種。將其轉化為蛋白質(zhì)組，定量了這些物種的14621個(gè)蛋白質(zhì)（WT為8249個(gè)，Akita小鼠為10847個(gè)），與Akita小鼠相比，SGLT2i在WT中的作用更強。系統發(fā)育概述總結了SGLT2i在WT小鼠中從門(mén)到科水平對微生物群的重新配置（圖4A）。在屬水平上，SGLT2i促使Akkermansia 和Lachnoclostridium增加，Acetatifactor和Bilophila減少（圖S6B）。
宏蛋白質(zhì)組的多樣性分析顯示，治療后糖尿病小鼠的α多樣性較高，而WT和糖尿病小鼠的對照和治療動(dòng)物的β多樣性顯著(zhù)不同。宏蛋白質(zhì)組分析還涵蓋了消化道的典型蛋白質(zhì)，其中大多數蛋白質(zhì)被SGLT2i 下調，34個(gè)下調，3個(gè)上調。與腎臟一樣，一些減少的蛋白質(zhì)參與營(yíng)養轉運，包括寡肽的Slc15a1、尿酸鹽/外源性分泌轉運蛋白 Abcg2和脂肪酸輸入的Slc27a4。
由于WT小鼠中SGLT2i改變的許多血漿溶質(zhì)是芳香族氨基酸的代謝物，因此分析了可以在蛋白質(zhì)組水平上代謝這些氨基酸的細菌的豐度。對于產(chǎn)生吲哚的細菌，發(fā)現表達色氨酸酶以從色氨酸產(chǎn)生吲哚的物種減少（吲哚丙烯酸；圖4B）。
使用苯丙氨酸等芳香族氨基酸作為底物可以減少甲酚和苯酚的生成劑（圖4B）。糞便代謝組檢測表明顯示糞便中存在達格列凈（圖4C）。在達格列凈治療小鼠的這些糞便樣本中，色氨酸和苯丙氨酸發(fā)酵的代謝物有所減少（圖4C）。為了探究達格列凈在糞便中的直接作用，將SGLT2i添加到人糞便中。厭氧發(fā)酵后，發(fā)現吲哚乳酸、色氨酸代謝物和肉桂酰甘氨酸減少（圖4D）；也就是說(shuō)，與WT小鼠血漿中SGLT2i 減少的化合物相關(guān)的化合物（圖3F）。在人體糞便發(fā)酵中添加SGLT2i也逆轉了這些毒素母體分子的消失，特別是芳香族氨基酸色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸（圖4D）。
這表明SGLT2i對微生物群產(chǎn)生較少尿毒癥毒素的生理作用也可能涉及SGLT2i對微生物群的直接影響。
圖4-代謝蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，SGLT2i重塑和減弱了氨基酸微生物組發(fā)酵為尿毒癥毒素的能力
6、SGLT2I對尿毒癥毒素代謝產(chǎn)物的凈減少不依賴(lài)SGLT2
作者進(jìn)一步檢測了還原的代謝物是否獨立于SGLT2蛋白的存在，以及這些影響是否在更長(cháng)的時(shí)期內保持。使用了SGLT2 KO小鼠模型（SGLT2 KO）。用SGLT2I（達格列凈）對SGLT2 KO和WT小鼠進(jìn)行了16周的正常飲食治療，分析了血漿和尿液，并使用保留代謝物小組進(jìn)行了血漿靶向分析(圖5A)。SGLT2 KO小鼠的血糖較低，葡萄糖排泄量較高，食物攝入量較高(圖5B和圖S6E)。在KO小鼠中，SGLT2i不影響這些措施中的任何一項。
在SGLT2 KO和WT小鼠中，許多代謝物的比率發(fā)生了類(lèi)似的變化，就像在WT小鼠中使用達格列凈和溶劑處理一樣(圖5C左圖)，這表明SGLT2抑制的后果。在其他方面，葡萄糖比率的下降，反映了尿糖排泄的增加。正如預期的那樣，SGLT2的缺失阻斷了達格列凈對葡萄糖排泄的影響(圖5C右圖)。另一方面，達格列凈顯著(zhù)改變了SGLT2 KO小鼠體內許多代謝物的比例，表明了一種偏離靶點(diǎn)的效應(圖5D)。血漿：尿液比例的排名變化顯示，達格列凈降低了SGLT2 KO小鼠中多種芳香酸代謝物的比例，包括甲酚和馬尿酸鹽，其次是色氨酸代謝物。血漿水平分析確定了SGLT2i在SGLT2 KO環(huán)境中顯著(zhù)改變的5種代謝物，包括PCL硫酸鹽和一種修飾的馬尿酸(圖5E和5F)。該實(shí)驗表明SGLT2i治療具有非靶點(diǎn)效應，包括對甲酚、馬尿酸鹽和色氨酸代謝物。
圖5-利用SGLT2 KO小鼠探索SGLT2i的代謝脫靶效應
7、SGLT2i的代謝器官通訊效應在人類(lèi)中是相關(guān)的
鑒于腎臟SGLT2相互作用組以及微生物對SGLT2i的反應在小鼠和人類(lèi)中相似，我們想知道SGLT2i是否會(huì )影響循環(huán)中的溶質(zhì)，在縱向數據中與心血管相關(guān)。對來(lái)自2個(gè)獨立研究的患者的血漿樣本進(jìn)行了靶向代謝組分析，目標是80個(gè)有機陰離子和尿毒癥毒素。在第一組>40名患者中，在失代償性心衰的真實(shí)環(huán)境中分析了這種影響(圖6A)。結果表明，SGLT2i顯著(zhù)降低或鈍化了心力衰竭患者血漿中幾種有機陰離子的增加，但僅當住院期間添加SGLT2i時(shí)(圖6B和6C)。包括幾種色氨酸代謝物，如ILA、犬尿酸和乙酰色氨酸，以及苯丙氨酸代謝物苯乙酰谷氨酰胺和PCL硫酸鹽。分析了在糖尿病患者中使用SGLT2I(依帕列凈)的隨機對照試驗的縱向數據(圖6D)。與基線(xiàn)和安慰劑相比，二甲基尿酸和三甲基尿酸的血漿濃度降低，PCL降低，吲哚代謝物增加緩慢(圖6E和6F)。在兩項臨床研究中，降低的溶質(zhì)大部分來(lái)自嘌呤代謝和腸道芳香氨基酸代謝，這與在小鼠身上觀(guān)察到的代謝器官一致。
圖6-SGLT2i 誘導的尿毒癥毒素減少也適用于人類(lèi)
8、SGLT2i依賴(lài)代謝物對甲酚誘導人EHT應激信號
在人類(lèi)、小鼠（包括Sglt2 KO小鼠）和大鼠研究中的不同循環(huán)代謝物之間觀(guān)察到一致的總體趨勢（圖7A），在觀(guān)察到的所有系統中，SGLT2i均一致降低PCL硫酸鹽或 PCL。為了分析這種化合物對人體組織的影響，將hiPSC EHT暴露于PCL。PCL在先前報道的患者濃度（300 μM）68,69 下改變了心肌細胞的松弛時(shí)間（圖7B）。數小時(shí)內濃度提高十倍（低mM 范圍）顯著(zhù)降低了力和頻率（圖7C和圖S7A），當 EHT 受到頻率控制時(shí)也是如此（圖S7B）。PCL 對 EHT 的影響是部分可逆的，可以通過(guò)洗掉化合物來(lái)恢復（圖7C ）。
為了進(jìn)一步闡明該機制，對用300μM PCL、吲哚乳酸和3種其他芳香族代謝物處理的 EHT 組織進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析（圖7D）。觀(guān)察到最強烈的變化是 PCL 的反應（圖7D）。多種蛋白質(zhì)的增加包括心臟病相關(guān)通道TRPM4、 FLNA和生長(cháng)因子CCN1；減少的蛋白質(zhì)包括 PPP1R1A，其下調已被報道為人類(lèi)HF的標志。PCL改變的蛋白質(zhì)組的一個(gè)獨特特征是心臟肌節相關(guān)蛋白的減少（圖S7D），以及應激信號 GDF15的強烈感應（圖7E）?？紤]到HF患者中該通路的調節，檢測了GDF15 水平，發(fā)現接受SGLT2i治療心力衰竭的患者循環(huán) GDF15 減少（圖7F）。
圖7-SGLT2i調節的尿毒癥毒素對甲酚對人體工程心臟組織的影響
研究總結
該研究通過(guò)整合多個(gè)代謝器官和體液樣品，進(jìn)行了深入的蛋白質(zhì)組學(xué)、磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)分析，發(fā)現SGLT2i減少了尿毒癥毒素（如對甲酚硫酸鹽）的微生物群形成，從而減少了它們的體內暴露和腎臟解毒的需要，結合SGLT2i對腎臟的直接影響，包括較少的近端小管葡萄糖毒性和對頂端轉運體（包括鈉、氨基酸和尿酸鹽的攝?。┑膹V泛下調，為腎臟和心血管保護提供了代謝基礎。該研究提供的資源為更深入地了解SGLT2抑制劑對代謝、腎臟和心臟功能的影響，從而對維持心血管健康提供了新的見(jiàn)解。
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期刊名稱(chēng)：Molecular Plant
影響因子：21.949
發(fā)表單位：中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所
研究部位：高等植物及綠色生物
研究方法：磷酸化蛋白質(zhì)組、PRM靶向蛋白組
研究背景
2023年11月27日，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所汪迎春團隊在Molecular Plant在線(xiàn)發(fā)表了題為GreenPhos, a universal method for in-depth measurement of plant phosphoproteomes with high quantitative reproducibility?的研究論文。論文中報道了一種具有突破性的植物磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)新技術(shù)。該技術(shù)采用了簡(jiǎn)化、穩健的工作流程，有效地克服了植物磷酸化蛋白質(zhì)組分析的主要技術(shù)難點(diǎn)，能高靈敏度、高特異性快速地富集植物磷酸肽。利用該技術(shù)可定量分析不同植物的磷酸蛋白質(zhì)組，其分析深度之深、定量重復性之高前所未有，有望成為植物磷酸蛋白組學(xué)的通用技術(shù)。由于該技術(shù)主要面向高等植物及其它綠色生物（如衣藻），且操作簡(jiǎn)便，極大地降低了實(shí)驗所需的人力和試劑費用，因此命名為GreenPhos (綠磷)。
蛋白質(zhì)磷酸化在植物的生長(cháng)、發(fā)育、環(huán)境適應以及作物的產(chǎn)量和品質(zhì)調控中發(fā)揮著(zhù)重要的作用。深度解析磷酸化蛋白質(zhì)組是全面理解磷酸化如何行使功能的有效手段。然而，與動(dòng)物相比，植物磷酸化蛋白質(zhì)組的深度解析在技術(shù)上更具挑戰性。因為植物細胞具有致密的細胞壁和大量的包括色素在內的次生代謝物，前者極大地增加了蛋白質(zhì)提取的難度，而后者嚴重地干擾了磷酸肽富集的效率和特異性。
實(shí)驗材料
野生型擬南芥(Col-0)幼苗在10%漂白劑中表面消毒，在無(wú)菌去離子水中漂洗，然后播種在含有1%瓊脂，pH為5.8的半強度Murashige和Skoog (1/2 MS)培養基上。種子在4℃的黑暗條件下發(fā)芽2天。幼苗在1/2 MS固體培養基上生長(cháng)10天，然后轉移到1/2 MS液體培養基上，再培養16小時(shí)。在鹽脅迫實(shí)驗中，將幼苗轉移到添加或不添加(對照) 100mM NaCl的新鮮培養基中，根據需要孵育30 min或120 min。
研究結果
1.GreenPhos的開(kāi)發(fā)——一種穩定高效的純化植物磷酸肽的方法
從植物組織中高效提取蛋白質(zhì)是深入分析植物蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組的第一步和關(guān)鍵一步。為此，作者比較了SDS、GdnHCl和SDC等不同變性劑對擬南芥葉片中蛋白質(zhì)的提取性能。結果發(fā)現SDS-和SDC-提取的蛋白的性能相似，但優(yōu)于GdnHCl。植物樣品相較于動(dòng)物樣品含有較低濃度的蛋白質(zhì)，因此作者優(yōu)化了磷酸化蛋白質(zhì)組的提取和富集的方法，即用SDS或GdnHCl緩沖液提取的蛋白質(zhì)樣品，在蛋白質(zhì)消化和隨后的磷酸肽富集之前，必須去除變性劑(圖1A)。接著(zhù)用氯仿-甲醇沉淀提取的樣品，去除變性劑和其他干擾生物分子(圖1A和1B)。而作者通過(guò)實(shí)驗發(fā)現，SDC法提取的蛋白樣本不需要經(jīng)過(guò)氯仿-甲醇沉淀，而鑒定到的磷酸化蛋白更多，同時(shí)需要的植物材料更少。因此作者認為SDC法更節省成本達到更好的效果，并在番茄、水稻、綠藻等生物中得到驗證，從而確定了磷酸化蛋白組學(xué)的方法，稱(chēng)之為GreenPhos。
圖1 GreenPhos的工作流程
2.?GreenPhos與當前磷酸肽富集方法的比較
GreenPhos與當前基于polyMAC的磷酸肽制備方法相比，在上機蛋白等量的情況下，GreenPhos方法平均鑒定出11072個(gè)磷酸化位點(diǎn)，而polymac法鑒定出9399個(gè)磷酸化位點(diǎn) (圖2B)，表明GreenPhos的分析深度比PolyMAC的高18%，并且需要的樣本量更少，省去了更多的實(shí)驗步驟和時(shí)間。與此同時(shí)，作者發(fā)現GreenPhos的富集選擇性(92%)也高于PolyMAC的富集選擇性(54%)（圖2C）?？赡茉蚴谴紊x物的存在影響了磷酸肽對TiO2珠的親和力，PolyMAC優(yōu)先富集磷酸化肽，而GreenPhos富集了更多的雙重或多重磷酸化肽(圖2D-E)?？傊?，在當前實(shí)驗條件下，GreenPhos優(yōu)于基于polyMAC的方法。
圖2 GreenPhos和基于polyMAC的方法的性能比較
為了進(jìn)一步測試GreenPhos的效率和靈敏度，作者從擬南芥葉片中提取蛋白質(zhì)(100、300、600和900μg)，分別從4個(gè)樣品中分別富集磷酸肽，并通過(guò)LC-MS分析（圖3A）。通過(guò)比較鑒定出的磷位點(diǎn)和磷酸肽的數量，發(fā)現兩者都隨著(zhù)上機量的增加而增加，達到600μg后鑒定出的磷酸化位點(diǎn)和磷酸化肽的小幅增加 (圖3A和3B)。說(shuō)明鑒定的磷酸化位點(diǎn)的數量與起始蛋白的數量不存在正相關(guān)，因為L(cháng)C-MS在使用相同的獲取參數時(shí)是飽和的。
為了評估GreenPhos在定量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)中的潛力，作者了鑒定的磷酸化肽與上機量之間的定量關(guān)系。以900μg為參照，在100、300和600μg中，檢測到的磷酸肽強度比與參考中磷酸肽強度比的中位數與理論值具有很好的相關(guān)性(圖3C)。分析結果表明，GreenPhos與單次LC-MS結合可用于從高達600μg的蛋白質(zhì)中定量磷酸肽，準確度高。通過(guò)5次重復質(zhì)譜分析，評價(jià)了GreenPhos在植物磷蛋白組定量鑒定中的再現性。5個(gè)生物重復和5個(gè)技術(shù)重復的磷酸肽強度的Pearson相關(guān)系數平均分別為0.95和0.97 (圖3D和3E)，表明具有較高的定量可重復性。從5個(gè)生物重復中共鑒定出磷酸化位點(diǎn)14063個(gè)，其中74%的磷酸化位點(diǎn)至少在2個(gè)重復中鑒定出 (圖3F)。結果表明，GreenPhos可以在定量和定性上產(chǎn)生高度可重復性的結果。
圖3 GreenPhos的靈敏度、定量準確度和重現性評價(jià)
4.?利用GreenPhos對擬南芥鹽脅迫誘導的磷酸化蛋白組分析
為了深入了解擬南芥對鹽脅迫響應中蛋白磷酸化介導的信號，作者使用GreenPhos和單次LC-MS檢測，分析了100 mM NaCl處理30分鐘(T30)和120分鐘(T120)或未處理(T0)的擬南芥幼苗的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)(圖4A)。每個(gè)處理包括3個(gè)生物學(xué)重復，每個(gè)重復600μg蛋白用于磷酸肽的富集?？偣矎?316個(gè)磷酸化蛋白中鑒定出12908個(gè)磷酸肽，含有15889個(gè)磷酸化位點(diǎn)。在磷酸肽中，13473個(gè)磷酸位點(diǎn)在處理的至少一個(gè)重復中包含可量化的信息。
對三個(gè)重復中至少任意兩個(gè)重復中的11128個(gè)磷酸位點(diǎn)進(jìn)行了label free定量。采用p< 0.05篩選不同處理間存在差異的磷酸化位點(diǎn)。聚類(lèi)分析顯示，磷酸化蛋白形成了四個(gè)不同的簇，顯示了鹽脅迫誘導的磷酸化水平在所有處理中表現出顯著(zhù)差異(圖4B)。在簇1中，磷酸化水平在鹽脅迫30 min后適度下降，在120 min后升高。在簇2中，磷酸化水平在30 min時(shí)總體上升，而在120 min后維持在相似的水平。在簇3中，磷酸化水平在30 min時(shí)沒(méi)有顯著(zhù)變化，在120 min時(shí)下降。在簇4中，磷酸化水平在30 min鹽脅迫下下降，并在120 min時(shí)維持在類(lèi)似的水平。
圖4 利用GreenPhos定量鑒定鹽脅迫下分析擬南芥幼苗磷酸化蛋白組
使用Fisher’s-exact對每個(gè)簇中的磷酸化蛋白進(jìn)行GO和KEGG富集分析(圖5)。與報道一致，在細胞組分條目，細胞核、細胞質(zhì)和細胞膜蛋白在所有簇中被顯著(zhù)富集。在分子功能條目，激酶活性在簇1、2和4中富集，而在簇3中不富集，但是蛋白質(zhì)去磷酸化的在生物過(guò)程條目在簇3中富集。結果表明，激酶的磷酸化激活和磷酸酶的去磷酸化是鹽脅迫誘導的重要反應。
圖5 鹽脅迫誘導的差異磷酸化蛋白的功能富集
激酶通常通過(guò)識別特定的序列motif來(lái)磷酸化它們的底物，即磷酸化motif。使用motif-x算法?(https://meme-suite.org/meme/tools/momo)選擇在任意兩個(gè)處理中表現出差異水平的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行磷酸化motif分析。在處理T30/T0之間顯示磷酸化增加的磷酸化位點(diǎn)中，四個(gè)motif?(SP、SDxE、SDxD和LxxxxS)被過(guò)度表達，而兩個(gè)motif?(SP和RxxS)在顯示磷酸化降低的磷酸化位點(diǎn)中過(guò)度表達(圖6A)。同樣，在120 min鹽脅迫(T120/T0)下，在磷酸化位點(diǎn)中，分別有4個(gè)motif（SP、SDxE、SDxD和SxxE）和3個(gè)motif（SP、RxxS、SxxE）的水平升高或降低(圖6B)。兩種處理(T120/T30)的比較顯示，在120 min鹽脅迫下，兩個(gè)motif（SP、SD）和motif（SP）在磷酸化位點(diǎn)中被過(guò)度表達，分別表現出更高和更低的磷酸化水平(圖6C)。
在所有處理中，富含脯氨酸的motif (SP)在上調和下調的磷酸位點(diǎn)中都被過(guò)度表達，并且通過(guò)PRM進(jìn)一步驗證了β-淀粉酶1 (BAM1)上含有S55的一個(gè)motif (圖6)。緊接著(zhù)作者鑒定了5個(gè)CDPKs的12個(gè)磷酸位點(diǎn)和3個(gè)MAPK上的4個(gè)磷酸位點(diǎn)，包括MPK19激活環(huán)上的一個(gè)磷酸位點(diǎn)，這些激酶被認為和鹽脅迫相關(guān)。綜上所述，包括MAPKs和CDPKs在內的多種激酶在鹽脅迫中起作用。
圖6 磷酸化對鹽脅迫的反應
除了激酶外，在簇1、2和4中剪接體被KEGG通路顯著(zhù)富集 (圖5)，暗示磷酸化調控mRNA的可變剪接，是植物響應脅迫的關(guān)鍵過(guò)程。在鹽脅迫下，18個(gè)剪接體蛋白上共有28個(gè)不同的位點(diǎn)被差異磷酸化 (圖7)。利用PRM進(jìn)一步驗證了Y209在SCL30上的差異磷酸化(圖6)。據報道，RNA解旋酶及其磷酸化對剪接體的組裝至關(guān)重要。在鹽脅迫30分鐘后，Prp5的S210、S442和S444位點(diǎn)磷酸化增加，并在120分鐘后保持高水平，Prp19的多個(gè)亞基也觀(guān)察到類(lèi)似的磷酸化模式(圖7)。盡管這些差異磷酸化事件的意義尚未得到明確的證明，但它們可能參與了鹽脅迫誘導的mRNA剪接的調控。
圖7 鹽脅迫誘導剪接體蛋白的差異磷酸化
研究總結
GreenPhos不僅極大地提高了植物磷酸化蛋白質(zhì)組的解析效率，而且也顯著(zhù)地減低了實(shí)驗操作的難度和成本，為更深入地理解蛋白質(zhì)磷酸化在植物生命過(guò)程中的功能提供了強有力的工具。該研究成果將有效推進(jìn)磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)與植物生物學(xué)和農學(xué)等領(lǐng)域的交叉融合，在發(fā)掘與作物產(chǎn)量、品質(zhì)以及抗逆密切相關(guān)的磷酸化蛋白及其位點(diǎn)中有著(zhù)廣泛的應用前景。
Duan?X,?Zhang?Y,?Huang?X,?Ma?X,?Gao?H,?Wang?Y,?Xiao?Z,?Huang?C,?Wang?Z,?Li?B,?Yang?W,?Wang?Y.?GreenPhos,?a?universal?method?for?in-depth?measurement?of?plant?phosphoproteomes?with?high?quantitative?reproducibility.?Mol?Plant.?2023?Nov?27:S1674-2052(23)00393-3.?doi:?10.1016/j.molp.2023.11.010.?Epub?ahead?of?print.?PMID:?38018035.
今天，整理了2篇相關(guān)文獻追蹤帶給大家~
應用研究論文一：糖尿病高發(fā)人群的血清代謝組學(xué)和血糖變化：西班牙裔社區健康研究/拉丁裔研究
主要研究?jì)热?/h4>
01 受試者特征-臨床指標
在平均6年的隨訪(fǎng)期間，對西班牙裔社區健康研究/拉丁裔研究(HCHS/SOL)受試者中發(fā)現了224例糖尿病發(fā)病案例。與未患糖尿病的人相比，糖尿病身高體重指數(BMI)、腰臀比(WHR)、舒張壓(DBP)和甘油三酯水平較高，但高密度脂蛋白(LPL)水平較低。與非糖尿病患者相比，糖尿病患者中使用降壓和降脂藥物以及糖尿病家族史的頻率也更高。
02 脂質(zhì)和氨基酸類(lèi)代謝物與糖尿病
在對臨床相關(guān)指標進(jìn)行研究之后，對624種已知代謝物進(jìn)行研究，發(fā)現其中有134種代謝物與糖尿病發(fā)病顯著(zhù)相關(guān)。110種代謝物與糖尿病風(fēng)險呈正相關(guān)，而其余24種代謝物與糖尿病風(fēng)險呈負相關(guān)。這134種重要代謝物主要包括脂質(zhì)(41.8%)和氨基酸(35.8%)類(lèi)物質(zhì)。
03 代謝物模塊與糖尿病風(fēng)險
通過(guò)網(wǎng)絡(luò )分析，發(fā)現最終形成了10個(gè)代謝物模塊，其中某些代謝物是與之前研究的代謝物一致(如脂質(zhì)類(lèi)物質(zhì)和AA代謝物模塊)，均與糖尿病的發(fā)病相關(guān)。而另一些模塊可能由與糖尿病相關(guān)的新代謝物組成。大多數代謝物模塊與6年來(lái)各種血糖特征的變化有關(guān)，這些變化方向與糖尿病發(fā)病關(guān)聯(lián)的方向一致。同時(shí)證實(shí)了許多葡萄糖和能量代謝有關(guān)的代謝物與糖尿病發(fā)病是高度相關(guān)的。
此外的研究過(guò)程中，發(fā)現了雄激素-類(lèi)固醇代謝物與糖尿病風(fēng)險的潛在新關(guān)聯(lián)。這些代謝物是硫酸化雄烯二醇和雄烷二醇。同時(shí)發(fā)現這些代謝物在男性中的水平高于女性，并隨著(zhù)年齡的增長(cháng)而下降。但在本文的研究中，發(fā)現它們與糖尿病風(fēng)險正相關(guān)。進(jìn)一步分析表明，只有在這些雄激素水平非常高的男性中，糖尿病的風(fēng)險才會(huì )顯著(zhù)增加。
β-隱黃質(zhì)、異檸檬酸、蘇氨酸、N-甲基脯氨酸、草酸和酒石酸，與水果和蔬菜的飲食攝入量呈正相關(guān)，與糖尿病風(fēng)險呈負相關(guān)。這些代謝物存在于水果和蔬菜中，且其中一些代謝物(即β-隱黃質(zhì)、蘇氨酸、N-甲基脯氨酸)作為健康飲食模式的關(guān)鍵生物標志物存在。
參考文獻：【IF：9.5】
Chai JC, Chen GC, Yu B, Xing J, Li J, Khambaty T, Perreira KM, Perera MJ, Vidot DC, Castaneda SF, Selvin E, Rebholz CM, Daviglus ML, Cai J, Van Horn L, Isasi CR, Sun Q, Hawkins M, Xue X, Boerwinkle E, Kaplan RC, Qi Q. Serum Metabolomics of Incident Diabetes and Glycemic Changes in a Population With High Diabetes Burden: The Hispanic Community Health Study/Study of Latinos. Diabetes. 2022 Jun 1;71(6):1338-1349. doi: 10.2337/db21-1056.
應用研究論文二：糖尿病的蛋白組預測因子：社區動(dòng)脈粥樣硬化患病風(fēng)險（ARlC）研究
主要研究?jì)热?/h4>
該研究選擇6010名北美社區動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(ARIC)研究參與者，同時(shí)進(jìn)行內部驗證隊列（2913名ARIC研究參與者）和外部驗證隊列（新加坡多民族（MEC）巢式病例對照研究，對照組1214名，糖尿病組624名）的構建，對4955種血漿蛋白質(zhì)與糖尿病發(fā)病機制的相關(guān)性進(jìn)行了分析。鑒定了47種預測糖尿病發(fā)生發(fā)展的血漿蛋白質(zhì),建立了3種蛋白質(zhì)的因果效應并確定了對診斷和治療具有潛在意義的糖尿病相關(guān)炎癥和脂質(zhì)通路。
01 糖尿病相關(guān)蛋白的發(fā)現
發(fā)現隊列（6010例）的參與者中，1435例確診為糖尿病患者?；诘鞍捉M學(xué)結果，初步分析有596種蛋白質(zhì)呈現顯著(zhù)差異且與糖尿病發(fā)生風(fēng)險相關(guān)。在對人口統計學(xué)、eGFR、生活方式、心臟代謝危險因素及BMI進(jìn)行分析后，發(fā)現有140種蛋白與糖尿病風(fēng)險相關(guān)。其中ADIPOQ、SLITRK3、IGFBP2、APOF、HTRA1與糖尿病發(fā)生風(fēng)險相關(guān)性最大。
02 糖尿病相關(guān)蛋白質(zhì)的驗證
內部驗證：在內部驗證樣本（n=2913）中，有712例確診為糖尿病。同時(shí)在發(fā)現集中鑒定到64種蛋白質(zhì)與糖尿病發(fā)生發(fā)展具有顯著(zhù)相關(guān)性。其中包括25種已知的與糖尿病發(fā)生相關(guān)的蛋白質(zhì)。
外部驗證：對于這64種蛋白質(zhì)，進(jìn)一步在來(lái)自新加坡的外部隊列MEC（對照組1214名，糖尿病組624名）中進(jìn)行了驗證。其中有47種與糖尿病的發(fā)生發(fā)展具有顯著(zhù)相關(guān)性。
03 蛋白質(zhì)通路分析
作者采用Ingenuity Pathway Analysis（IPA）通路分析，結果顯示最關(guān)鍵的生物通路是急性期反應信號通路。在上游調控因子分析中，發(fā)現促炎性細胞因子IL17a被確定為糖尿病相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò )的上游調節因子。而另一個(gè)上游調節因子是腫瘤壞死因子，作為細胞因子和炎癥信號的主要調節因子存在。
04 遺傳分析
作者通過(guò)蛋白組關(guān)聯(lián)分析和全基因組關(guān)聯(lián)分析的雙孟德?tīng)栯S機化分析，確定了所構建模型的64種蛋白質(zhì)中的3種SHBG、ATP1B2和GSTA1在糖尿病發(fā)病中的因果關(guān)系。
參考文獻：【IF：17.1】
Rooney MR, Chen J, Echouffo-Tcheugui JB, Walker KA, Schlosser P, Surapaneni A, Tang O, Chen J, Ballantyne CM, Boerwinkle E, Ndumele CE, Demmer RT, Pankow JS, Lutsey PL, Wagenknecht LE, Liang Y, Sim X, van Dam R, Tai ES, Grams ME, Selvin E, Coresh J. Proteomic Predictors of Incident Diabetes: Results From the Atherosclerosis Risk in Communities (ARIC) Study. Diabetes Care. 2023 Apr 1;46(4):733-741. doi: 10.2337/dc22-1830.
糖尿病發(fā)病機制及藥物治療機制的總結
●設計取樣：不同時(shí)期或者階段的糖尿病病人、包括但不限于二甲雙胍治療的糖尿病病人
●樣本類(lèi)型：血漿、血清
●組學(xué)手段：代謝組、蛋白組、微生物、轉錄組
●最終目的：研究糖尿病的發(fā)病機制或藥物治療糖尿病的靶點(diǎn)所在
●實(shí)驗設計：
