研究背景

小球藻為單細胞可食用綠藻，能夠合成蝦青素和油脂；蝦青素是一種結構獨特的酮式類(lèi)胡蘿卜素，是自然界已知最強的抗氧化劑。含油脂高的藻類(lèi)可作為生物質(zhì)能源。

實(shí)驗設計

材料選擇：小球藻 取種子細胞培養到生長(cháng)對數期的后期，分成3組，用于做不同處理；
處理方式：對照組T1：不做處理；
高光處理組T2：光照90μmol光子?2 s?1，6h；
葡萄糖誘導組T3：30g/L葡萄糖處理， 6h；
測序方法：Hiseq2500，4G/樣；

技術(shù)路線(xiàn)：

研究結果

1. 蝦青素和脂類(lèi)定量分析

對照和葡萄糖處理組相比，葡萄糖誘導下的小球藻中，蝦青素含量96h后增加了30倍，而處理組中96h后只增加了8倍。脂類(lèi)和TFA含量也有類(lèi)似的情況。對照組中這三種成分增加較少可能是培養基中營(yíng)養成分限制的原因，在氮饑餓的情況下，導致在相同器官中蝦青素和脂肪酸產(chǎn)量增加。

2. RNA-SEQ分析

三種不同的處理構建三個(gè)文庫，測序獲得clean data 10.63G，Trinty組裝獲得32931個(gè)unigenes。52.8%的unigenes在NR,Swiss-Prot,KEGG,GO,COG獲得注釋。

3. 差異表達基因分析

計算RPKM，做差異表達分析。T1與T2差異表達基因數為580，T1與T2差異表達基因數為1489。在光處理和葡萄糖處理兩種情況下，差異基因功能注釋表明這些基因都是與翻譯、核糖體、蛋白過(guò)程、脅迫和碳固定相關(guān)的。在光處理下，卟啉和葉綠素代謝、光刺激應答是被富集的。在葡萄糖處理情況想，葡萄糖、能量產(chǎn)生和轉化、脂肪合成等都是被富集的；而這些基因在光合作用、核糖體、蛋白運輸通路中是減少的。在碳源充足的情況下，生長(cháng)和能量存儲基因是上調表達的，而光合作用是下調表達的。

4. RT-PCR驗證

作者選了10個(gè)與蝦青素和三酰甘油合成有關(guān)的unigenes進(jìn)行了RT-PCR驗證，其中9個(gè)基因的表達趨勢與RNA-seq結果一致。只有PDS兩種結果不同，可能是RNA-seq結果不準確，因為前人的研究成果中，葡萄糖是上調PDS表達的，與本文中RT-PCR結果一致。

5. 蝦青素合成

在轉錄組測序結果中，發(fā)現MEP通路中的8個(gè)基因都被鑒定到，但是在MVA通路中只有2個(gè)基因被檢測到，其中HMG表達不顯著(zhù)，ACAT表達量下降。這些結果表明小球藻中蝦青素的合成通路中IPP和DMAPP是MEP通路合成的。其中，發(fā)現一個(gè)可能編碼β-胡蘿卜素激酶（BKT2）與數據庫中的BKT1比對率僅為56%。功能分析發(fā)現BKT2可以轉化β-胡蘿卜素成為角黃素。下圖為蝦青素合成通路圖。在葡萄糖處理情況下，與蝦青素合成相關(guān)的6個(gè)基因上調差異表達。在小球藻中，葡萄糖誘導蝦青素的合成，伴隨著(zhù)BKT1，CHYb,PDS在24h內上調表達。為研究轉錄組水平基因表達量與產(chǎn)物含量的關(guān)系，分析了5個(gè)限速基因的表達量，這些基因在葡萄糖處理72h或92h表達量達到最高，相應的，蝦青素的積累量也在96h達到穩定水平。

6. 三酰甘油的合成

藻類(lèi)和植物中脂肪酸的生物合成主要在葉綠體中進(jìn)行。乙酰-CoA作為合成的起始物質(zhì)?；谵D錄組測序，小球藻質(zhì)體中脂肪酸合成基因被鑒定到。在葡萄糖處理情況下，這些基因大都表達量上調。另外這次測序結果中還發(fā)現幾個(gè)基因對應的不同轉錄本。由于BC和SAD是脂肪酸合成的限速酶基因，做了進(jìn)一步分析，發(fā)現BC和SAD表達量從6h到72h表達量持續上升，對應的三酰甘油含量從24h到96h持續增加。

三酰甘油（TAG）合成有兩條通路：乙酰-CoA依賴(lài)的通路和乙酰-CoA不依賴(lài)的通路；轉錄組數據中兩條通路中的基因都被鑒定到。

文章亮點(diǎn)

1：材料選擇+處理條件；
小球藻關(guān)注的成分具有重要的經(jīng)濟價(jià)值，處理條件是可以促進(jìn)經(jīng)濟成分積累，研究更加有利用價(jià)值；

2：實(shí)驗數據+前人結果，深入驗證；
測序結果中重點(diǎn)關(guān)注關(guān)鍵成分（蝦青素和TAG）合成通路中的每一個(gè)基因，對其進(jìn)行差異分析，并做不同時(shí)期的表達量分析；解釋清楚在處理情況下，物質(zhì)合成與基因表達的關(guān)系。針對本文的研究結果與前人研究成果比較分析。