《Science》ARF3介導的生長(cháng)素信號對黃瓜性別決定至關(guān)重要
該研究揭開(kāi)了生長(cháng)素促進(jìn)雌花產(chǎn)生的神秘機制，鑒定到關(guān)鍵調控因子CsARF3（Auxin?Response?Factor?3），并闡釋了生長(cháng)素和乙烯在性別決定上的互惠關(guān)系，為植物性別決定的調控網(wǎng)絡(luò )提供了全新的認識。百邁客生物為該研究提供了轉錄組測序及分析服務(wù)！
研究背景
古人識草木，多辨“花葉果”之形，卻少知其“性別”之異。
被子植物的性別決定，不僅是進(jìn)化成功的重要標志，更是解鎖農業(yè)增產(chǎn)、推動(dòng)雜交制種的關(guān)鍵密碼。植物性別并非僅由染色體決定，還受基因調控、激素水平、環(huán)境信號（溫度、光照、養分）的調控，其復雜性遠超動(dòng)物。
葫蘆科作物性型表現豐富，已逐漸成為研究性別決定的典型模式植物。葫蘆科作物的花在早期發(fā)育階段是兩性的，隨著(zhù)心皮原基或雄蕊原基的發(fā)育停滯產(chǎn)生單性花?！吧L(cháng)素促進(jìn)雌花產(chǎn)生”這一現象自上世紀50年代被植物學(xué)家觀(guān)察到以來(lái)，一直是植物生理學(xué)領(lǐng)域的“未解之謎”，且生長(cháng)素與乙烯是如何協(xié)同調控植物單性花發(fā)育的遺傳機制仍模糊不清。
研究?jì)热菁敖Y果
CsARF3是黃瓜雌花形成所必需的
該研究首先發(fā)現，外源施加生長(cháng)素（IAA）可提高黃瓜雌雄花比例。在16個(gè)黃瓜ARF家族成員中，CsARF3在雌性系WI1983G的雌花芽中表達顯著(zhù)高于其近等基因系WI1983GM（ACS1G突變，以雄花為主）的雄花芽，且在性別決定期（第6期之前）的表達更高（圖1A-G）。利用CRISPR/Cas9技術(shù)構建的Csarf3移碼突變體（Csarf3-1和Csarf3-2）僅產(chǎn)生雄花，而野生型（WT）為雌雄同株（圖1H,?I）。突變體部分雄花在心皮殘留部位出現花柱樣組織，其比例與野生型的雌花比例相似，暗示Csarf3突變導致雌花向雄花轉化（圖1J,?K）。相反，CsARF3過(guò)表達株系（CsARF3-OE）的雌花比例和復合雌性（每節多雌花）比例均顯著(zhù)增加（圖1L,?M）。外源IAA處理無(wú)法恢復Csarf3突變體的雌花產(chǎn)生，表明CsARF3介導的生長(cháng)素信號是黃瓜雌花形成不可或缺的環(huán)節。
圖1 CsARF3 促進(jìn)黃瓜中的雌性化
CsARF3直接調控CsSTM和CsWIP1的表達
KNOX家族轉錄因子參與莖端分生組織（SAM）形成和心皮發(fā)育。研究發(fā)現，Csarf3突變體異常心皮中多數KNOX?I類(lèi)成員表達下調，其中CsSTM（SHOOT?MERISTEMLESS同源基因）下降最為顯著(zhù)（圖2A）。CsSTM在雌花芽中表達高于雄花芽，在Csarf3突變體莖尖中表達降低，而在CsARF3-OE株系中上調（圖2B-D）。酵母單雜交、凝膠遷移實(shí)驗（EMSA）和染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP-qPCR）證實(shí)，CsARF3可直接結合CsSTM啟動(dòng)子中的生長(cháng)素響應元件（AuxREs），并激活其轉錄（圖2E-H,?I）。CsSTM在性別決定前特異性富集于雌花的心皮原基。敲除CsSTM導致雌花比例下降和首朵雌花出現延遲，而Csarf3?Csstm雙突變體的表型與Csstm單突變體相似，表明CsSTM位于CsARF3下游共同促進(jìn)雌花形成（圖2J,?K）。
圖2 CsARF3 通過(guò)直接刺激黃瓜中的CsSTM表達來(lái)促進(jìn)雌性化
另一方面，雌性抑制基因CsWIP1在Csarf3突變體中表達上調約3倍，在CsARF3-OE中下調（圖3A,?B）。CsARF3可直接結合CsWIP1啟動(dòng)子上的AuxRE元件并抑制其轉錄（圖3C-F）。遺傳分析顯示，Csarf3?Cswip1雙突變體恢復了雌雄同株表型，產(chǎn)生雌花和兩性花，類(lèi)似于Cswip1單突變體（僅雌花），證明CsARF3作用于CsWIP1上游抑制其功能以促進(jìn)雌性發(fā)育（圖4A-D）。
圖3 CsARF3負向調控CsWIP1在心皮發(fā)育中的表達
CsARF3與乙烯生物合成基因的遺傳關(guān)系
乙烯生物合成基因ACS1G（F基因）是黃瓜雌性表型的關(guān)鍵因子。研究發(fā)現，外源乙烯利（ethephon）處理不能誘導Csarf3突變體產(chǎn)生雌花，而生長(cháng)素處理卻能恢復乙烯生物合成突變體Csacs11和Csaco2（僅雄花）的雌花形成。將Csarf3突變引入攜帶ACS1G的雌性系中，發(fā)現CsARF3的缺失阻斷了ACS1G誘導的雌花發(fā)育（圖4E-H），表明乙烯需要通過(guò)生長(cháng)素通路促進(jìn)心皮發(fā)育。此外，黃瓜中ACS7同源基因CsACS2在Csarf3和Csstm突變體中表達顯著(zhù)下調，在CsARF3-OE中上調（圖4I-K），說(shuō)明生長(cháng)素信號能促進(jìn)乙烯生物合成，兩者在性別決定中形成互饋循環(huán)。
圖4 黃瓜中已知性別決定基因與CsARF3的遺傳關(guān)系
研究總結
該研究不僅破解了“生長(cháng)素促進(jìn)黃瓜雌花產(chǎn)生”之謎，極大豐富了被子植物單性花發(fā)育調控網(wǎng)絡(luò )，而且為理解激素信號如何調控植物器官發(fā)育提供了全新的視角，為農業(yè)生產(chǎn)中的作物性別調控提供了精準的分子靶點(diǎn)。
以上內容來(lái)源于中國農業(yè)大學(xué)，侵刪
]]>
黃瓜是人們生活中常見(jiàn)的新鮮果蔬，深受大眾消費者喜歡。今天給大家推薦的這篇文章是前不久揚州大學(xué)陳學(xué)好老師課題組的研究成果“The major-effect quantitative trait locus Fnl7.1?encodes a late embryogenesis abundant protein associated with fruit neck length in cucumber”，該研究報道了一個(gè)黃瓜果把長(cháng)度調控的主效基因，并闡述其遺傳機制，最終該成果發(fā)表在國際知名期刊Plant Biotechnology Journal（IF=8.15）。該文章采用的思路和方法，從事植物發(fā)育類(lèi)性狀研究的老師們可以借鑒，其中最重要的基礎工作BSA定位由百邁客生物提供。
研究背景
黃瓜果把長(cháng)度（fruit neck length，FNL）是影響黃瓜品質(zhì)和商業(yè)價(jià)值的重要性狀之一，由于果把無(wú)肉質(zhì)組織、有苦味，而且易被折斷，因此現代育種的方向是短把黃瓜。關(guān)于黃瓜果把長(cháng)度的遺傳特征研究較少，多篇文章報道了數個(gè)QTL位點(diǎn)，而且這些QTL解釋的表型變異率變化較大，但是相關(guān)基因一直沒(méi)有被克隆。
研究?jì)热?/strong>
本研究首先通過(guò)長(cháng)果把品種Jin5-508和短把品種YN雜交構建的性狀分離群體（F2和F2:3），從F2中選擇果把長(cháng)度極端個(gè)體構建DNA混池進(jìn)行高通量測序，BSA分析和傳統遺傳圖譜共同在7號染色體上定位到一個(gè)主效QTL。再通過(guò)分離群體精細定位、基因表達分析、轉基因驗證等方法確定了調控果把長(cháng)度基因CsFnl7.1。同時(shí)發(fā)現CsFnl7.1啟動(dòng)子區域的多態(tài)性調控CsFnl7.1的表達水平。結合自然群體材料的多樣性分析，發(fā)現CsFnl7.1位點(diǎn)可能起源于印度。
文章思路
主要結果
01 黃瓜果把長(cháng)度的遺傳特征
授粉30天后，雙親Jin5-508和YN黃瓜果把長(cháng)度不再增長(cháng)，于是選擇該時(shí)間節點(diǎn)作為果把長(cháng)度鑒定的時(shí)期（圖1a）。Jin5-508果把長(cháng)度顯著(zhù)長(cháng)于YN，這種差異是因為Jin5-508果把果肉細胞體積大于YN，而非細胞數增多（圖1b,c,d,e）。統計F1群體、回交群體和F2群體果把長(cháng)度發(fā)現，F1群體表現出中親表型，而回交群體表型更偏向于輪回親本，F2群體表現出連續的近正態(tài)分布（圖1f），以上結果表明黃瓜果把長(cháng)度是數量性狀。
圖1?黃瓜果把長(cháng)度遺傳特征
02果把長(cháng)度QTL的初定位—BSA方法+遺傳圖譜
作者在1231個(gè)F2群體（Jin5-508 × YN）選擇了長(cháng)把和短把單株各50個(gè)，構建2個(gè)極端性狀DNA混池，對該混池及雙親進(jìn)行高通量測序及BSA分析。親本測序深度分別為34x（Jin5-508）和20x（YN），混池測序深度分別為61x和52x。測序數據與黃瓜參考基因組9930比對，2個(gè)混池分別開(kāi)發(fā)了342,496和399,764個(gè)SNP，基于SNP index算法，在chr7上定位到一個(gè)主效QTLFnl7.1?(閾值0.833)，區間范圍9.98–14.61 Mb（圖2c）。
圖2?BSA定位結果
為驗證BSA的定位結果，作者在3個(gè)不同環(huán)境下調查了102個(gè)F2:3家系（Jin5-508 ×?YN）的表型，結果顯示F2:3表型也符合正態(tài)分布（圖3a）?；陔p親重測序數據，作者在7號染色體上開(kāi)發(fā)了72個(gè)雙親多態(tài)標記（SNP和InDel），用這些標記合F2群體構建7號染色體的連鎖圖譜。結合F2:3群體3個(gè)環(huán)境的表型以及F2遺傳圖譜，共同定位到了1個(gè)主效QTL（圖3b），表型貢獻率在27.9%-32.7%。綜合BSA定位和遺傳圖譜定位結果，最終吧QTL Fnl7.1定位在7號染色體上2.85Mb的區間內。
圖3?F2:3群體表型變異及遺傳圖譜定位結果
03 Fnl7.1的精細定位
作者利用初定位側翼標記InDel01和SNP01對大規模F2單株（4000株）進(jìn)行分型，篩選得到51個(gè)區間重組單株。在InDel01和SNP01區間內又開(kāi)發(fā)了另外4個(gè)標記，對51個(gè)重組單株進(jìn)行分型，共得到10種不同的單體型，基于個(gè)體表型及單體型數據，Fnl7.1被縮小到25.4kb的區間（標記InDel05和SNP01）（圖4c）。為了進(jìn)一步縮小區間范圍（老師態(tài)度很?chē)乐?，佩服），作者又構建了一個(gè)更大規模的F2分離群體（7600個(gè)單株），利用InDel05和SNP01進(jìn)行分型后又得到4個(gè)F2重組單株。F2重組單株自交得到4個(gè)F2:3群體，在InDel05–SNP01區間內又開(kāi)發(fā)了4個(gè)多態(tài)SNP標記，用這些標記對F2:3群體進(jìn)行篩選，發(fā)現有2個(gè)F2:3群體在標記區間內發(fā)生了重組。利用重組單株的表型及單倍型分型結果，將Fnl7.1定位在14.1kb的區間（圖4d），而在該區間內共有2個(gè)基因，分別為CsGy7G014720和CsGy7G014730（圖4e）。
圖4?Fnl7.1精細定位過(guò)程
04 Fnl7.1功能驗證
克隆雙親14.1kb定位區間，測序后進(jìn)行序列比對發(fā)現共有17個(gè)SNP和InDel差異，部分變異位于基因間區、內含子區，而位于外顯子區的則為非同義突變，另外在CsGy7G014720啟動(dòng)子區有多個(gè)變異。同時(shí)，作者發(fā)現InDel05（位于CsGy7G014720啟動(dòng)子區）與Fnl7.1共分離。以上結果表明，CsGy7G014720（后續稱(chēng)作CsFnl7.1）是最有可能的候選基因。
圖5?CsFnl7.1表達分析
05 CsFnl7.1啟動(dòng)子多態(tài)性影響其表達
序列分析顯示，雙親CsFnl7.1啟動(dòng)子區存在多處序列差異（25個(gè)SNPs和7個(gè)InDels），因此作者將雙親的啟動(dòng)子進(jìn)行了克隆，分別與GUS基因構建整合質(zhì)粒，轉化煙草葉片進(jìn)行啟動(dòng)子活性分析。發(fā)現Jin5-508啟動(dòng)子（pCsLEAJ）活性是YN啟動(dòng)子（pCsLEAY）活性的4倍（圖6）。這與轉錄組分析結果一致（授粉當天CsFnl7.1在Jin5-508表達量顯著(zhù)高于YN），從而說(shuō)明CsFnl7.1表達受順式調控。
圖6?雙親CsFnl7.1啟動(dòng)子活性比較
06? CsFnl7.1轉基因植株表現
為進(jìn)一步驗證基因功能，作者將CsFnl7.1轉入短把品種“D8”中，得到3個(gè)T2代單株（OE4、OE7和OE8）。Southern雜交顯示OE4、OE7和OE8分別插入1、1和2個(gè)拷貝（圖7a）。與對照相比，3個(gè)轉基因個(gè)體CsFnl7.1表達量顯著(zhù)提高，同時(shí)果把長(cháng)度也更長(cháng)，說(shuō)明CsFnl7.1確實(shí)能夠影響果把長(cháng)度（圖7b,c,d）。分析果把果肉細胞的個(gè)數和大小發(fā)現，轉基因個(gè)體比對照個(gè)體細胞更大，但細胞數在兩者之間沒(méi)有顯著(zhù)差異（圖7e,f,g），從而說(shuō)明CsFnl7.1是通過(guò)調控細胞伸展來(lái)影響果把長(cháng)度。
圖7?CsFnl7.1轉基因個(gè)體表現
07? CsFnl7.1與細胞伸展相關(guān)蛋白存在互做
利用酵母雙雜技術(shù)，以CsFnl7.1蛋白為誘餌篩選與其互做的蛋白，結果顯示共得到53個(gè)陽(yáng)性克隆，在這些蛋白中有多個(gè)與細胞伸展相關(guān)，包括CsDRP6和CsGLP1（圖8a）。體外pull down實(shí)驗顯示，融合蛋白HIS-CsDRP6和HIS-CsGLP1可以被GST-CsFnl7.1高效捕獲，而對照GST則不能（圖8b）。以上結果充分說(shuō)明CsFnl7.1與CsDRP6、CsGLP1之間存在互做關(guān)系。
圖8?酵母雙雜及pull?down分析
08? Fnl7.1的地理分布及進(jìn)化分析
利用Fnl7.1啟動(dòng)區的變異信息，對158個(gè)品種進(jìn)行進(jìn)化分析，結果顯示所有品種可被分為4個(gè)group，其中g(shù)roup1和group2主要包含來(lái)自于歐亞大陸的端果把品種，而group3主要為來(lái)自于東亞的短果把品種，來(lái)自印度多個(gè)品種在3個(gè)不同group都有分布，以上結果也可以證實(shí)Fnl7.1起源于印度的假說(shuō)。
總結
本文是一篇典型的基因克隆+驗證的優(yōu)秀文章，從事農作物、蔬菜功能基因研究的老師可以引用參考。該研究亮點(diǎn)是使用大規模F2分離群體，通過(guò)BSA分析+重組個(gè)體分析，就實(shí)現了基因的精細定位，從而避免了構建高代回交群體的繁瑣過(guò)程，極大地縮短了基因克隆的周期，減少了多年雜交、標記篩選等工作流程。當然，能夠采用這種策略，也與物種繁殖周期、產(chǎn)籽量、QTL貢獻率等多個(gè)因素相關(guān)（我們會(huì )在下期著(zhù)重討論這些問(wèn)題），本研究的物種和性狀特征符合上述要求，所以能夠快速拿到基因。在這篇文章之前，2018年陳學(xué)好老師在The Plant Journal（IF=6.14）上發(fā)表了一篇黃瓜耐水淹基因克隆驗證的文章“The major-effect quantitative trait locus CsARN6.1?encodes an AAA ATPase domain-containing protein that is associated with waterlogging stress tolerance by promoting adventitious root formation”，文章思路和方法與本文基本相似，也是采用大規模F2分離群體+BSA分析的方式，感興趣的老師可以參考學(xué)習。我們不難看出，只要方法選的對，再加上細致的研究工作，就可以持續發(fā)表高分文章！
提前劇透
百邁客云平臺BSA分析APP即將上線(xiàn)?。?！該APP整合了目前最主流的BSA分析流程，定位結果準確有保證；分析過(guò)程簡(jiǎn)單易上手，從數據上傳到參數設置，再到基因組選擇，只需要簡(jiǎn)單3步就可以完成項目數據投遞和分析；結題報告云交付，分析完成即可拿到項目結題報告；多種常見(jiàn)定制化分析，助力BSA數據深入挖掘。目前，BSA分析APP正在緊鑼密鼓的抗壓測試中，不久就會(huì )投入到實(shí)際應用中，為廣大科研工作者提供簡(jiǎn)便、快捷、準確的BSA分析，敬請期待！
參考文獻
Xu, X., Wei, C., Liu, Q., Qu, W., Qi, X., Xu, Q.and Chen, X. (2020) The major-effect quantitative trait locusFnl7.1?encodes a late embryogenesis abundant protein associated with fruit neck length in cucumber. Plant Biotechnol. J., https://doi.org/10.1111/pbi.13326