Nanopore全長(cháng)轉錄組測序

nanopore全長(cháng)轉錄組測序是指基于牛津納米孔公司（Oxford Nanopore Technologies，ONT）三代測序平臺進(jìn)行全長(cháng)轉錄組測序。全長(cháng)轉錄組測序，無(wú)需打斷，基于三代測序平臺直接獲取轉錄本的5ˊ到3ˊ高質(zhì)量全長(cháng)序列，可準確識別可變剪接、基因融合、可選擇性多聚腺苷酸化APA、等位基因特異性表達等轉錄本結構方面變異?；趎anopore三代測序平臺進(jìn)行全長(cháng)轉錄組測序，除了可準確鑒別上述轉錄本結構變異，還可實(shí)現轉錄本（mRNA或polyA+ lncRNA）表達水平準確定量。

主要在于測序平臺不同。Illumina平臺主要是PE150測序，構建小片段文庫，為邊合成邊測序，在建庫以及測序過(guò)程中均需要PCR擴增，主要用于基因水平表達定量及差異表達分析。nanopre全長(cháng)轉錄組測序無(wú)需打斷RNA，可獲得5’到3’全長(cháng)轉錄本序列及其表達信息，對片段大小無(wú)偏好，直接檢測電信號無(wú)需邊合成邊測序其GC偏好性遠低于二代平臺；同時(shí)由于無(wú)需拼接其在轉錄本層面的結構變異檢測方面，比如可變剪接、融合基因、APA、新基因預測等具有絕對優(yōu)勢。

nanopore測序是基于電信號識別堿基序列的三代測序技術(shù)。DNA/RNA上不同堿基或帶不同修飾時(shí)化學(xué)性質(zhì)存在差異，當單鏈分子通過(guò)納米孔通道時(shí)，堿基造成的阻礙大小不一，因此會(huì )形成特征性離子電流變化信號。通過(guò)對這些信號進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測，即可獲得相應堿基類(lèi)型，完成測序。目前通過(guò)“遞歸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò )（Recurrent Neural Network）”的復雜算法對堿基進(jìn)行判讀。

其特點(diǎn)為：

1）讀長(cháng)長(cháng)：最長(cháng)讀長(cháng)能達到2 Mb以上級別[ref1]，有利于可變剪接、基因融合等結構變異檢測；
2）低成本：相比其他三代測序技術(shù)，ONT測序樣本處理極其簡(jiǎn)單，無(wú)需DNA聚合酶、連接酶和dNTPs，測序價(jià)格低；
3）測序過(guò)程不涉及PCR擴增：避免二代測序中PCR擴增可能引入的錯誤或豐度變化；
4）direct-RNA/DNA方式建庫，可直接獲取堿基修飾信息，如甲基化修飾5mC、6mA等，無(wú)須像二代測序需要經(jīng)過(guò)重硫酸鹽轉化或者免疫沉淀富集實(shí)驗；
5）低GC含量和堿基偏好性，針對RNA測序無(wú)需打斷，轉錄本水平表達定量更準確。

二代轉錄組測序一般基于邊合成邊測序二代短讀長(cháng)的Illumina等平臺，由于讀長(cháng)短（通常PE 150bp），需要進(jìn)行片斷化，打斷到200-300bp，測序過(guò)程需要DNA聚合酶和dNTPs以及進(jìn)行橋式PCR形成clusters放大熒光信號。
從二代轉錄組到nanopore三代全長(cháng)轉錄組，平臺升級，技術(shù)革新，解決二代不能解決的問(wèn)題！

樣品類(lèi)型：PolyA RNA；樣品濃度：≥50 ng/ul（Qubit HS RNA定量）； 樣品總量：cDNA-direct方式：>250ng（單次）；總量>750 ng；（若提供總RNA，動(dòng)物樣品總量需按照PolyA RNA要求的100倍以上準備）； cDNA-PCR方式：>1μg（單次）；總量>3μg 樣品純度：OD260/280 ~2.0，OD260/230在2.0-2.2 之間，260nm處有正常峰值；樣品無(wú)基因組DNA污染； 總RNA完整性： RIN值≥8.0，28S/18S≥1.0；圖譜基線(xiàn)無(wú)上抬；5S峰正常。

研究表明，生物學(xué)重復可提高所有基因表達水平鑒定的準確性，而增加測序深度主要提高低表達基因表達量鑒定準確性。每種處理條件下至少3個(gè)生物學(xué)重復，當研究樣本的生物學(xué)差異比較高，或者想研究更多的微小表達差異/fold change時(shí)，需要更多生物學(xué)重復。也就是，比如對于個(gè)體差異較大的臨床樣本可以5-10個(gè)/組以上，而生物學(xué)差異較小的細胞系樣本則每組3個(gè)生物學(xué)重復以上即可。

• 首先，轉錄本表達定量，是指針對一個(gè)基因的多個(gè)不同轉錄本(transcript)分別進(jìn)行表達定量。而基因水平定量，可以理解為一個(gè)基因所有轉錄本表達定量的加和。
• 多數公司二代轉錄組測序不提供一個(gè)基因的多個(gè)轉錄本分別定量的結果，原因在于二代轉錄組測序并適用于這種情況。二代短測序單條read無(wú)法跨越全長(cháng)轉錄本，其表達定量在reads比對完成后需要用諸如StringTie等軟件進(jìn)行短reads組裝拼接得到轉錄本再進(jìn)行其表達量評估。
• 那么，二代轉錄組測序可能會(huì )存在拼接錯誤或者是拼接不完整，不能準確獲得完整轉錄本，導致各個(gè)轉錄本水平表達定量不準確。
• 尤為重要的是，二代測序對于一個(gè)基因的多個(gè)轉錄本得到的reads，尤其是多個(gè)轉錄本共享的外顯子區對應reads無(wú)法區分其來(lái)源轉錄本，導致轉錄本水平定量不準確。
• 還有一些情況，當不同基因具有比較相似的高度保守區時(shí)，這些區域的短reads也無(wú)法準確區分其來(lái)源基因/轉錄本，即存在多比對的現象，這也導致轉錄本甚至基因水平表達定量存在偏倚。
• nanopore三代全長(cháng)測序無(wú)需對各轉錄本打斷和拼接，一條read即可跨越全長(cháng)轉錄本，多比對率也比較低，因此能夠準確獲取一個(gè)基因的多個(gè)全長(cháng)轉錄本各自的表達信息。

注：上圖中藍色方塊表示測到RNA序列中能夠比對到基因組序列的區域，即屬于某個(gè)轉錄本外顯子區的reads；灰色線(xiàn)條表示我們測到的reads回比基因組序列時(shí)中間沒(méi)有比對上的，則用灰色線(xiàn)條連接，即reads不連續比對，中間被剪接掉的內含子區。從圖中明顯看出，二代短reads比較短，多數短read單條連一個(gè)外顯子區都跨越不了，nanopore長(cháng)讀長(cháng)測序可以直接得到3種全長(cháng)轉錄本。其中，Exon2和Exon6以及Exon9是三個(gè)轉錄本間共享的，那么對于完全比對到這3個(gè)外顯子區的短reads無(wú)法區分其來(lái)源轉錄本。而三代測序則直接跨越三個(gè)全長(cháng)轉錄本，因此對于轉錄本水平表達定量更準確。

• 來(lái)自同一基因的多個(gè)轉錄本可能行使不同功能，二代測序由于片段化測序導致對轉錄本水平定量不準確，對于轉錄本水平表達定量存在固有缺陷，nanopore三代測序彌補了此方面不足，尤其是對于基因水平不顯著(zhù)差異表達的基因，該基因的某些轉錄本可能顯著(zhù)差異表達，這些轉錄本可能具有重要生物學(xué)作用。比如有些基因的某些轉錄本只在特定條件下才表達。如果不能對轉錄本水平進(jìn)行準確定量，則可能遺漏這些可能具有重要生物學(xué)功能的轉錄本。

• 人類(lèi)中約95%基因存在可變剪接AS事件、70%以上基因存在A(yíng)PA現象[ref3]。AS、APA和fusion等是轉錄本多樣性以及蛋白多樣性的來(lái)源，多樣性轉錄本或蛋白發(fā)揮不同功能。

• 由于全長(cháng)轉錄本序列的獲得，使得nanopore全長(cháng)轉錄組測序在鑒定可變剪接（alternative splicing, AS）、可選擇性多聚腺苷酸化（APA）以及融合轉錄本（fusion transcripts）等轉錄本層面的結構變異更準確，這是之前三代長(cháng)讀長(cháng)測序廣為熟知的應用。
• 目前利用二代Illumina高通量測序方法進(jìn)行可變剪切的檢測與分析非常普遍，但由于二代測序的讀長(cháng)短，在準確預測完整的isoform全長(cháng)序列方面存在問(wèn)題，同時(shí)存在難以判斷轉錄起始位點(diǎn)（TSS）和轉錄終止位點(diǎn)（TTS）的位置、難以判斷哪些外顯子是連接在一起的問(wèn)題。
• 針對同時(shí)發(fā)生多個(gè)外顯子跳躍和內含保留等復雜轉錄本鑒定更是無(wú)能為力。

• 利用二代短序列測序來(lái)檢測融合基因存在一些問(wèn)題：基因組重復序列以及多比對率比較高使得檢測結果不準確。
• 二代測序技術(shù)中為了研究APA已經(jīng)開(kāi)發(fā)了不下于10種實(shí)驗技術(shù)方法，比如polyA-seq，雖然其可以提取準確的polyA位置，但oligo(dT)引物可能結合到轉錄本內部的連續A序列，導致假陽(yáng)性率高，后續需要RNA Pol II結合等額外實(shí)驗驗證這些連續A序列確實(shí)是由APA引起的；而如果不進(jìn)行專(zhuān)門(mén)的polyA-seq，普通的二代轉錄組測序對APA檢測效能低下，只能鑒定到約0.003％含有polyA的reads，并且短3’UTR通常嵌在長(cháng)的UTR中，因此具有短3’UTR的isoform通常被轉錄組裝工具忽視。[ref5]
• nanopore三代全長(cháng)測序無(wú)需對各轉錄本打斷和拼接，poly(A)會(huì )出現在測序結果中，并且可以得到從5’到3’的完整全長(cháng)轉錄本，其多比對率也比較低，因此能夠準確鑒定轉錄本水平各結構變異。

使用三種納米孔建庫方式（PCR-cDNA、direct-cDNA和direct-RNA）數據和典型的短讀長(cháng)cDNA技術(shù)制備酵母轉錄組文庫進(jìn)行比較：

a）在所有情況下，納米孔長(cháng)讀長(cháng)數據集的GC偏好都比短讀長(cháng)數據集低。

b）與短讀長(cháng)測序數據相比，納米孔長(cháng)讀長(cháng)測序數據的長(cháng)度偏倚都較小。

綜上，nanopore全長(cháng)轉錄組測序受基因的GC含量和長(cháng)度偏好更小。

——圖片來(lái)源于Oxford Nanopore Technologies官方白皮書(shū)The value of full-length transcripts without bias。

ONT平臺目前我司下機數據堿基質(zhì)量Q值平均約在10左右，即堿基平均錯誤率為10^(-1)=10%左右，但這是單堿基錯誤率；

比對時(shí)用的是全長(cháng)序列和參考基因組或參考轉錄組進(jìn)行比對，序列越長(cháng)比對時(shí)對于堿基錯配度容忍越高，因此不會(huì )對表達定量有影響；

當然由于比二代單堿基錯誤率高，故而百邁客將SNP和InDel檢測分析內容去除了，因此想從RNA水平檢測snp/indel的客戶(hù)可能考慮做二代轉錄組測序。其實(shí)目前不乏使用nanopore測序數據檢測snp的文章，如NC|nanopore全基因組重測序鑒定人類(lèi)基因組非同義新生SNP。

下面列舉了2個(gè)百邁客真實(shí)項目的數據質(zhì)量表，大家可以參考。

ONT全長(cháng)轉錄組測序一條reads即代表該轉錄本表達一次，而二代短reads需要非常多條才能覆蓋一個(gè)轉錄本；oxford nanopore公司官方白皮書(shū)中數據顯示：當相同數量的轉錄本被覆蓋達95%時(shí)，ONT所需要的reads數比Illumina約少50倍，所需要堿基數約少7倍。

故而2G ONT數據能達到6G Illumina檢測效果；

——圖片來(lái)源于Oxford Nanopore Technologies官方白皮書(shū)The value of full-length transcripts without bias。

針對同一樣本進(jìn)行的飽和度分析顯示，2G ONT全長(cháng)除表達量極低的（CPM<1）其他轉錄本都達到飽和了，和二代Illumina 6G除表達量極低FPKM<1外的基因檢測也飽和了，且前者更早趨向飽和；

目前已發(fā)表的人鼠文獻中ONT全長(cháng)測序的數據量大多也不到2G，比如文獻精讀|nanopore全長(cháng)轉錄組測序揭示B細胞表面受體廣泛的轉錄變異。

應用于慢性淋巴細胞白血病

英文題目：Full-length transcript characterization of SF3B1 mutation in chronic lymphocytic leukemia reveals downregulation of retained introns
發(fā)表雜志：Nature Communications
發(fā)表時(shí)間：2020.03
影響因子：11.878
使用Nanopore分別對慢性淋巴細胞白血?。–LL）分離的SF3B1野生型，突變株和正常組B細胞樣本進(jìn)行全長(cháng)轉錄組測序?；贜anopore的全長(cháng)cDNA測序可以檢測轉錄本全長(cháng)，通過(guò)算法優(yōu)化，相對于短序列，可以更準確的檢測3′末端剪切，內含子保留，分辨生產(chǎn)性異構體和非生產(chǎn)性異構體。該研究證明了Nanopore測序在癌癥和可變剪切中的潛在使用價(jià)值。

應用于精神疾病

英文題目：Long-read sequencing reveals the complex splicing profile of the psychiatric risk gene CACNA1C in human brain
發(fā)表雜志：Mol. Psychiatry
發(fā)表時(shí)間：2020.03
影響因子：11.973
在人腦中，與精神分裂癥相關(guān)的基因組區域富集了在神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中表現出不同異構體使用的基因，本文通過(guò)ONT全長(cháng)轉錄組技術(shù)研究疾病相關(guān)的CACNA1C亞型，有可能提供既有效又無(wú)外周副作用的新型精神藥物。

應用于阿爾茨海默病

英文題目：Deleterious ABCA7 mutations and transcript rescue mechanisms in early onset Alzheimer’s disease
發(fā)表雜志：Acta Neuropathol
發(fā)表時(shí)間：2017.09
影響因子：14.251
阿爾茨海默?。ˋD）是一種起病隱匿的進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統退行性疾病。本文研究了ABCA7 PTC突變在一個(gè)大型早發(fā)性AD對照隊列中的患病率和疾病外顯性，并用ONT全長(cháng)轉錄組檢查了其對轉錄水平的影響。揭示了不同程度的NMD和轉錄修飾事件，可能影響ABCA7的劑量、疾病的嚴重程度，并可能為AD的治療干預創(chuàng )造機會(huì )。

應用于多囊腎病

英文題目：Human-Specific Abnormal Alternative Splicing of Wild-Type PKD1 Induces Premature Termination of Polycystin-1
發(fā)表雜志：Journal of The American Society of Nephrology
發(fā)表時(shí)間：2018.10
影響因子：9.274
常染色體顯性遺傳性多囊腎病的主要形式是由編碼多囊蛋白-1(PC1)的基因雜合突變引起的，通過(guò)ONT全長(cháng)轉錄組測序等方法確認存在多種剪接形式。研究發(fā)現，在雜合子個(gè)體中，低水平的全長(cháng)PC1可能會(huì )將多囊蛋白信號降低到臨界的“成囊”閾值以下。

應用于乳腺癌

英文題目：Nanopore sequencing of full-length BRCA1 mRNA transcripts reveals co-occurrence of known exon skipping events
發(fā)表雜志：Breast Cancer Res
發(fā)表時(shí)間：2017.11
影響因子：4.988
本研究探索了納米孔測序技術(shù)在檢測整個(gè)BRCA1 mRNA轉錄本以及對框內和框外剪接事件進(jìn)行準確分類(lèi)方面的應用。研究鑒定了32個(gè)完整的BRCA1亞型，其中包括18個(gè)新的亞型，還發(fā)現已知的BRCA1外顯子跳躍事件，如Δ(9，10)和Δ21。這些發(fā)現對預測剪接轉錄本的翻譯框架具有重要意義，對解釋剪接變異體的臨床意義也很重要。

應用于肺癌

英文題目：Long read sequencing reveals a novel class of structural aberrations in cancers:identification and characterization of cancerous local amplifications
bioRxiv
本研究中利用ONT全長(cháng)轉錄組和ONT重測序技術(shù)在肺癌基因組中識別和表征結構畸變，揭示了由局部重復、倒位和微缺失的復雜組合組成的獨特結構畸變CLCL，進(jìn)一步分析并發(fā)現，即使在關(guān)鍵的癌癥相關(guān)基因中，這些突變也發(fā)生在體內，這些突變可能闡明了致癌性事件和治療策略仍然難以捉摸的患者的分子病因。

應用于細胞表面受體

英文題目：Nanopore long-read RNAseq reveals widespread transcriptional variation among the surface receptors of individual B cells
發(fā)表雜志：Nature Communications
發(fā)表時(shí)間：2017.07
影響因子：12.121
短reads RNAseq解析復雜isoform的能力有限，因為它無(wú)法測序RNA分子的全長(cháng)cDNA拷貝。作者研究了使用長(cháng)讀取單分子Oxford Nanopore測序儀的RNAseq是否能夠在不犧牲準確的基因表達定量的情況下，鑒定和定量復雜的isoform。在小鼠B1a細胞中鑒定了數千個(gè)未注釋的轉錄起始和終止位點(diǎn)，以及數百個(gè)可變剪接事件，鑒定了在B1a細胞中表達的數百種基因，這些基因顯示出多種復雜的isoform，包括幾種B細胞特異性表面受體。本研究表明，可以在單細胞水平上識別和定量復雜的isoform。