近日,?天津醫科大學(xué)基礎醫學(xué)院在cell?reports雜志在線(xiàn)發(fā)表了研究論文”Single-cell?and?spatial?transcriptomics?reveal?the?pathogenesis?of?chronic?granulomatous?disease?in?a?natural?model”。
研究背景
慢性肉芽腫病（Chronic?Granulomatous?Disease,?CGD）是一種由NADPH氧化酶2（NOX2）復合體功能缺失突變引起的原發(fā)性免疫缺陷病。這種缺陷會(huì )導致產(chǎn)生ROS的多種先天免疫細胞受到損害，機體抵御微生物的能力下降，導致CGD患者易發(fā)生反復感染和過(guò)度炎癥反應。本研究通過(guò)構建自然CGD小鼠模型，結合單細胞轉錄組（scRNA-seq）和空間轉錄組技術(shù)（包括BMKMANU?S1000平臺），深入解析了CGD肺部肉芽腫形成的細胞與分子機制，從CGD肺肉芽腫組織中鑒定出具有NOS2高表達特征的中性粒細胞和MMP12+巨噬細胞，并提出MIF和Morbidity為CGD治療的潛在靶點(diǎn)。
研究?jì)热菁敖Y果
1、通過(guò)接觸清潔環(huán)境（CL）建立CGD肉芽腫模型
通過(guò)不同環(huán)境暴露（SPF或CL）實(shí)驗，系統研究了環(huán)境病原體對CGD遺傳背景小鼠表型的影響。表現為HE染色全肺葉顯微圖像可見(jiàn)CL環(huán)境下的Ncf2?/?小鼠肺部出現明顯的肉芽腫結構，伴隨炎癥細胞浸潤和組織壞死，其他組小鼠肺部正常。免疫熒光顯示肉芽腫中的巨噬細胞（CD68+）表達上皮標志物E-cadherin，提示巨噬細胞發(fā)生上皮樣轉化。通過(guò)ELISA法檢測CL?Ncf2?/?小鼠血清中的IL-1β和IFN-γ炎癥相關(guān)蛋白水平較CL?WT組增加。16S?rRNA/ITS?測序顯示CL?Ncf2?/?小鼠肺部細菌（如克雷伯菌和葡萄球菌）和真菌（如Talaromyces）負荷顯著(zhù)增加。
2、單細胞分辨率下小鼠肺部免疫景觀(guān)的分析
通過(guò)單細胞RNA測序和流式細胞術(shù)分析發(fā)現CGD小鼠肺部炎癥微環(huán)境以髓系細胞浸潤為主，提示其參與肉芽腫形成。其中單細胞測序，最終保留了25296個(gè)高質(zhì)量細胞樣本，每個(gè)細胞平均包含6466條比對讀數和1972個(gè)基因，并識別出9種免疫細胞類(lèi)型及九種基質(zhì)細胞類(lèi)型。還發(fā)現一個(gè)以細胞周期相關(guān)基因（Mki67和Top2a）高表達為特征的細胞簇。通過(guò)流式細胞術(shù)分析發(fā)現，CL?Ncf2?/?小鼠中CD11b高表達的F4/80+MDMs在比例和絕對數量上均顯著(zhù)增加，這些結果揭示了慢性肉芽腫性葡萄膜炎（CGD）小鼠在肺部感染過(guò)程中免疫細胞組成的顯著(zhù)變化，尤其是中性粒細胞和MDMs的明顯聚集現象。
3、CGD小鼠中性粒細胞的轉錄改變
研究顯示，中性粒細胞分為6個(gè)亞群，其中Neu6亞群在CL?Ncf2?/?小鼠中顯著(zhù)擴增且Neu6高表達促炎基因（如Nos2、Mif、Tnf、Il1b）。NO是一種在病原體清除過(guò)程中起關(guān)鍵作用由NOS2合成的可擴散小分子，CL?Ncf2?/?小鼠肺部的總NO生成量顯著(zhù)升高。流式驗證顯示CL?Ncf2?/?小鼠肺中NOS2high中性粒細胞比例顯著(zhù)增加。這些結果均提示NOS2high中性粒細胞通過(guò)產(chǎn)生一氧化氮（NO）和促炎因子，驅動(dòng)肉芽腫核心區的炎癥反應。
4、CGD小鼠單核細胞-巨噬細胞區室的轉錄改變
通過(guò)對巨噬細胞亞群進(jìn)行聚類(lèi)分析和功能富集，發(fā)現巨噬細胞分為5個(gè)亞群，Mac1亞群在CL?Ncf2?/?小鼠中顯著(zhù)增加。Mac1同時(shí)表達M1（Nos2）和M2（Arg1）標志物，以及促纖維化基因（如Mmp12、Spp1）。免疫熒光顯示MMP12+巨噬細胞特異性分布于肉芽腫外圍。以上結果提示MMP12+巨噬細胞具有混合表型，可能通過(guò)細胞外基質(zhì)重塑促進(jìn)肉芽腫的纖維化包裹。
5、空間轉錄組揭示肉芽腫結構
使用SeekSpace和BMKMANU?S1000平臺分析肺組織切片的空間轉錄組。研究表明肉芽腫核心區富集中性粒細胞（Neu6亞群），外圍富集巨噬細胞（Mac1亞群）和成纖維細胞。Mac1高表達促炎（Nos2）和促纖維化（Mmp12、Fn1）基因。成纖維細胞高表達膠原基因（Col1a1、Col4a1），提示其參與纖維化。
以上結果提示通過(guò)BMKMANU?S1000平臺進(jìn)行的空間轉錄組發(fā)現Neu6占據肉芽腫中心區域，而Mac1和成纖維細胞在外圍區域參與細胞外基質(zhì)重塑和纖維化包被過(guò)程。明確了肉芽腫中不同細胞的分布和功能分工，揭示了炎癥與纖維化的協(xié)同作用。
6、干預策略的效果驗證
通過(guò)對巨噬細胞亞群進(jìn)行聚類(lèi)分析和功能富集，發(fā)現巨噬細胞分為5個(gè)亞群，Mac1亞群在CL?Ncf2?/?小鼠中顯著(zhù)增加。Mac1同時(shí)表達M1（Nos2）和M2（Arg1）標志物，以及促纖維化基因（如Mmp12、Spp1）。免疫熒光顯示MMP12+巨噬細胞特異性分布于肉芽腫外圍。以上結果提示MMP12+巨噬細胞具有混合表型，可能通過(guò)細胞外基質(zhì)重塑促進(jìn)肉芽腫的纖維化包裹。
研究總結
首次通過(guò)環(huán)境暴露構建自然CGD模型，結合多組學(xué)技術(shù)解析肉芽腫的細胞和分子機制。本研究揭示了CGD肉芽腫中NOS2high中性粒細胞和MMP12+巨噬細胞的協(xié)同作用，并提出MIF和Morrbid作為潛在治療靶點(diǎn)，為CGD的精準干預提供了理論基礎。BMKMANU?S1000空間轉錄組通過(guò)高分辨率空間定位明確揭示了中性粒細胞（Neu6亞群）在肉芽腫核心、巨噬細胞（Mac1亞群）和成纖維細胞在外圍的分布。在基因表達驗證時(shí)確認了NOS2、MIF、IL-1β等基因在肉芽腫不同區域的差異表達，這一結果與scRNA-seq結果高度一致，展示了BMKMANU?S1000在疾病微環(huán)境研究中的高效性。
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