英文題目：CCR2+ monocytes promote memory CD8+ T-cell differentiation via membrane-bound TGF-β
研究單位：西安交通大學(xué)基礎醫學(xué)院院長(cháng)張保軍教授團隊
期刊名：cellular & molecular immunology
影響因子：21.8
樣本類(lèi)型：8-12周齡小鼠
文章采用技術(shù)：空間轉錄組測序、單細胞RNA測序（scRNA-seq）
引言
在對抗感染和腫瘤的免疫戰場(chǎng)上，記憶?CD8+?T?細胞是守護機體的「長(cháng)效衛士」，?它們能快速識別再次入侵的病原體或癌細胞，發(fā)動(dòng)強力攻擊。長(cháng)久以來(lái)，樹(shù)突狀細胞（DC）被認為是主導記憶?T?細胞分化的核心「指揮官」。研究人員通過(guò)整合單細胞RNA測序（scRNA-seq）和空間轉錄（BMKMANU?S1000）技術(shù)，揭示了單核細胞才是調控記憶?CD8+?T?細胞分化的關(guān)鍵「操盤(pán)手」，其奧秘藏在「細胞接觸」與「分子信號」的雙重機制中。其中BMKMANU?S1000空間轉錄組學(xué)平臺大放異彩，成為揭CCR2+單核細胞促進(jìn)記憶CD8+?T細胞分化的關(guān)鍵工具。
研究背景
CD8+?T細胞在適應性免疫中扮演著(zhù)關(guān)鍵角色，能夠保護機體免受病原體感染和消除惡性細胞。當CD8+?T細胞識別到抗原后，會(huì )迅速增殖并分化為效應CD8+?T細胞和記憶CD8+?T細胞。效應CD8+?T細胞負責即時(shí)清除感染，而記憶CD8+?T細胞則提供長(cháng)期保護，能夠在再次遇到相同抗原時(shí)迅速啟動(dòng)免疫反應。然而，單核細胞（monocytes）作為重要的髓系免疫細胞，雖在炎癥遷移中作用明確，但其是否直接參與T細胞分化尚無(wú)定論。
研究策略
動(dòng)物模型與樣本制備
實(shí)驗動(dòng)物：優(yōu)先選擇8-12周齡的CD45.1+/CD45.2+及OT-I轉基因小鼠
樣本制備：脾臟單細胞懸液通過(guò)機械分離和紅細胞裂解（ACK緩沖液）制備
技術(shù)手段
- 流式細胞術(shù)分析
細胞分選：從感染LM-WT的小鼠脾臟中分選出cDCs、moDCs和單核細胞等抗原呈遞細胞（APCs）
細胞刺激與培養：將分選出的APCs與OVA肽段體外共孵育后，過(guò)繼轉移到已接受初始OT-I+?CD8+?T細胞的WT受體小鼠體內，或與體外刺激的初始CD8+?T細胞共培養
表型檢測：通過(guò)流式細胞術(shù)檢測CD8+?T細胞的分化表型，包括記憶相關(guān)標記物（如cKit、Sca1、Bcl6、TCF1和Eomes）的表達
- 空間分辨轉錄組學(xué)
樣本處理：對感染第0天和第5天的小鼠脾臟組織進(jìn)行切片，并進(jìn)行H&E染色以確定組織形態(tài)學(xué)特征
空間轉錄組學(xué)分析：利用BMKMANU?S1000空間轉錄組學(xué)技術(shù)對脾臟切片進(jìn)行分析，揭示不同免疫細胞亞群在脾臟中的空間分布
數據整合：將scRNA-seq數據與空間轉錄組學(xué)數據進(jìn)行整合，通過(guò)Seurat等工具的FindTransferAnchors和TransferData函數，將scRNA-seq中識別的細胞類(lèi)型映射到空間轉錄組學(xué)數據中，實(shí)現細胞類(lèi)型的空間定位
- 免疫熒光染色
樣本處理：對感染第0天和第5天的小鼠脾臟組織進(jìn)行切片，并進(jìn)行免疫熒光染色
抗體選擇：使用特異性抗體標記CD8+?T細胞、單核細胞（CCR2+）、樹(shù)突狀細胞（CD11c+）等關(guān)鍵細胞類(lèi)型
結果分析：通過(guò)顯微鏡觀(guān)察并拍攝染色切片，分析不同細胞類(lèi)型在脾臟中的共定位關(guān)系
- 生物信息學(xué)分析
差異基因分析：利用Wilcoxon秩和檢驗等統計方法，識別不同細胞亞群間的差異表達基因
通路富集分析：通過(guò)ClusterProfiler等工具對差異表達基因進(jìn)行通路富集分析，揭示潛在的生物學(xué)過(guò)程
偽時(shí)間分析：利用Monocle3等工具構建細胞分化軌跡的偽時(shí)間軸，分析CD8+?T細胞亞群在分化過(guò)程中的基因表達變化
研究結果
研究結果一：通過(guò)空間分辨轉錄組學(xué)繪制急性感染后脾組織的圖譜
為了研究免疫反應過(guò)程中不同免疫細胞的空間分布和CD8+?T細胞分化的調節機制，研究人員通過(guò)整合單細胞RNA測序（scRNA-seq）和BMKMANU?S1000空間轉錄組（ST）技術(shù)，分析了急性感染模型中脾臟免疫細胞的空間分布與CD8??T細胞分化機制。實(shí)驗采用OT-I轉基因小鼠模型，通過(guò)李斯特菌（LM-OVA）感染誘導免疫反應，關(guān)鍵發(fā)現包括：1）脾臟形成7個(gè)功能集群（B細胞、T細胞、單核/巨噬細胞等）；2）感染后T/B細胞區擴大，APCs（B細胞、DC、巨噬細胞）在T細胞區外圍聚集；3）空間重組與T細胞分化（MP/TE亞群）顯著(zhù)相關(guān)。多組學(xué)整合揭示了免疫微環(huán)境的動(dòng)態(tài)調控機制，為理解感染中細胞互作提供了多組學(xué)視角。
研究結果二：急性感染期間效應和memoryCD8?T細胞分化軌跡不同
為了探索CD8+?T細胞分化的空間決定因素，特別是與近端細胞的相互作用，對于急性感染模型研究人員進(jìn)行了亞群分析、分化路徑分析和功能驗證，結果表明在急性感染中，IFN反應型CD8+?T細胞和CD8+MP?細胞之間分化軌跡的不同意味著(zhù)，效應和記憶CD8+?T細胞的命運決定于免疫反應的初始階段，而IFN應答和MP?CD8+?T細胞分別是效應和記憶CD8+?T細胞分化途徑的初始階段。
研究結果三：跨組織區域細胞亞群的鑒定和空間圖譜
為了研究脾臟免疫細胞在感染前后的動(dòng)態(tài)變化，研究人員通過(guò)整合單細胞RNA測序（scRNA-seq）和BMKMANU?S1000空間轉錄組（ST）技術(shù)，進(jìn)一步鑒定了供體和受體脾臟中的免疫細胞群。結果顯示：①細胞組成：從1.6萬(wàn)細胞中鑒定出19類(lèi)，包括CD8??T細胞亞群（如記憶前體和IFN反應性細胞）及髓系細胞。②動(dòng)態(tài)變化：感染后第5天，T細胞區從以初始CD8+?T細胞為主轉為記憶前體和效應細胞主導，且單核細胞取代DC成為主要浸潤的髓系細胞。③功能提示：不同的APC和CD8+?T細胞之間的相互作用在免疫反應和CD8+?T細胞的分化中起著(zhù)重要作用。
研究結果四：?jiǎn)魏思毎虲D8+?MP細胞的抗原依賴(lài)性共定位
為了探索不同細胞類(lèi)型之間潛在的細胞相互作用，研究人員通過(guò)評估特異性免疫細胞標記物的表達、免疫熒光染色及空間轉錄組分析，檢查了第0天和第5天脾臟中CD8+?T細胞和單核細胞的空間分布。結果顯示單核細胞和CD8+?MP細胞以抗原刺激依賴(lài)性的方式在空間上共定位，表明單核細胞可能對CD8+?MP細胞的分化有關(guān)鍵影響。
研究總結
CD8+T?細胞是適應性免疫的重要執行者；特別是記憶CD8+?T細胞對強效和長(cháng)期保護至關(guān)重要。CD8+?T細胞分化在轉錄水平上的調控機制已被廣泛研究。然而，人們對感染過(guò)程中效應和記憶CD8+?T細胞分化的空間要求仍然知之甚少。研究人員通過(guò)整合BMKMANU?S1000空間轉錄組（ST）技術(shù)和scRNA-seq技術(shù)，發(fā)現了記憶CD8+?T細胞分化的新機制，該機制涉及單核細胞和CD8+?MP細胞之間的解剖學(xué)鄰近性和TGF-β信號傳導。該研究結果闡述了記憶CD8+?T細胞命運決定的新機制，并強調單核細胞作為關(guān)鍵的APC群體，通過(guò)細胞間接觸依賴(lài)的方式在感染過(guò)程中促進(jìn)記憶CD8+?T細胞的分化。
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