雜志期刊：Scientific Reports
發(fā)表時(shí)間：2017年9月12日（online）
1.研究背景
植物類(lèi)病變(lesion mimic, LM)又稱(chēng)類(lèi)病斑，是指在沒(méi)有受到任何病原菌侵染的條件下，植物自發(fā)產(chǎn)生壞死斑點(diǎn)。這種局部細胞的壞死屬于細胞程序化死亡（PCD），細胞程序化死亡在植物生長(cháng)發(fā)育過(guò)程中廣泛存在，特別是受到生物或非生物脅迫，當受到不相容的病原菌感染時(shí)，植物可以在受感染的部位啟動(dòng)某種形式的PCD，以限制病原體的傳播，這是一種先天性的免疫反應，稱(chēng)為超敏反應（HR）。HR是植物細胞為限制病原菌生長(cháng)而快速死亡的一種方式，其誘導的細胞死亡可以激發(fā)鄰近組織的防衛反應(defense response)和植株的系統獲得性抗性(systemic acquired resistance，SAR)。
水稻與玉米類(lèi)病變突變體表型
研究HR信號轉導最有效的方式就是利用一類(lèi)表現型與病原菌侵染后HR癥狀類(lèi)似的突變體開(kāi)展工作，這些突變體稱(chēng)為類(lèi)病變突變體（lesion mimic mutation，LMM）。植物類(lèi)病斑突變體根據其表型特征及PCD發(fā)生是否可控，分為起始型突變體和擴散型突變體。前者是指在無(wú)病原菌侵染下，植物體自發(fā)形成一些位置和大小相對穩定的斑點(diǎn)；后者是指斑點(diǎn)形成后易擴散，且這種類(lèi)型的斑點(diǎn)之間沒(méi)有明顯的界限。研究發(fā)現，類(lèi)病變發(fā)生的機制相當復雜，主要受抗病、調控死亡及代謝相關(guān)基因的調控。其次，活性氧途徑、水楊酸、茉莉酸、乙烯以及一氧化氮在植物抗病和超敏反應中也發(fā)揮了重要作用。
2.實(shí)驗材料
轉錄組材料為lmd、oe21、NT，lmd突變體是從BpGH3.5轉基因株系中分離出；oe21株系是正常的BpGH3.5轉基因株系；對照材料是非轉基因的NT。
測序平臺：百邁客Illumina HiSeq 2500，PE125
3.結果解讀
1、lmd突變體表型鑒定
作者在研究BpGH3.5在樺樹(shù)中的功能時(shí)偶然獲得了lmd突變體。構建的21株OE-GH3.5株系中，唯獨lmd葉片表現出壞死斑點(diǎn)并伴有早衰的現象。這很明顯是一種病變的表現，當這種情況出現，很顯然我們要思考兩個(gè)問(wèn)題：
一、lmd獨特的表型顯然不是過(guò)量表達BpGH3.5導致的，那么引起lmd與其他20株BpGH3.5超表達株系表型差異的原因是什么？
二、是否是感染某種病原菌導致的lmd出現壞死斑點(diǎn)的表型。這兩個(gè)問(wèn)題的連接點(diǎn)就在于表型，但解決的方式不一樣。
一問(wèn)題解決的是lmd內部矛盾；二問(wèn)題探討的是外部因素。解決好這兩個(gè)問(wèn)題，也就揭開(kāi)了lmd身上的神秘面紗。在解決這個(gè)問(wèn)題之前，首先要明確lmd展現出的phenotype外部因素是什么？植物表現出壞死斑點(diǎn)，最容易聯(lián)想到病菌，但在木本植物培養基上的lmd幼苗同樣表現出了這種表型，這說(shuō)明引起lmd表型的原因并不是病原菌而是一種自發(fā)的現象，作者做出判斷lmd應該是一種lesion mimic mutants（LMM，類(lèi)病變突變體）。而關(guān)于lmd的內部矛盾也很好理解，超表達株系中某一株系表現出與眾不同的表型，很容易讓人想到是否是插入位點(diǎn)影響了某個(gè)重要功能基因。作者接下來(lái)就通過(guò)一系列實(shí)驗來(lái)求證這些觀(guān)點(diǎn)。
圖1：Lmd生長(cháng)相對遲緩
圖2：lmd葉片
圖3：立體顯微鏡下不同葉齡的葉片病變部位
類(lèi)病變突變體通常會(huì )表現出自發(fā)性的細胞程序性死亡（PCD），作者通過(guò)伊文思藍染色比較了lmd與NT、oe21的細胞死亡情況（圖4）；丙二醛含量檢測間接反映了lmd細胞損壞程度也更高（圖5）；
圖4：lmd葉片染色以及與NT、oe21的對比分析
圖5：MDA含量測定
2、細胞結構變化揭示lmd突變體表型
細胞程序性死亡經(jīng)常伴隨著(zhù)細胞結構的變化，光學(xué)顯微鏡顯示lmd突變體的死細胞聚集在一起，而周?chē)募毎钦＝Y構的，死細胞并沒(méi)有明顯擴散痕跡（圖6），表明lmd是起始型的類(lèi)病變突變體。接下來(lái)作者用透射電鏡觀(guān)察了lmd葉片細胞的超微結構。與oe21和NT相比，在lmd突變體中觀(guān)察到更多的死細胞，一些細胞產(chǎn)生吞噬作用，細胞器消失，只留下一個(gè)空細胞壁（圖7），這一結果表明了lmd突變體中發(fā)生了典型的細胞程序性死亡。樺樹(shù)葉片上有許多葉腺，在葉片成熟后會(huì )退化。由于lmd表現出葉片早衰現象，作者用掃描電鏡掃描葉片表面，以觀(guān)察lmd是否有變化。在第三個(gè)葉片上，發(fā)現lmd葉片上的葉腺體比NT和oe21葉片少（圖8）。SEM觀(guān)察表明，lmd確實(shí)發(fā)生了早衰。
圖6:切片顯示病變部位發(fā)生細胞死亡
圖7：投射電鏡觀(guān)察細胞超微結構
圖8：葉腺體結構觀(guān)察
3、轉錄組揭示lmd體內的分子水平變化
為了深入了解lmd體內的分子水平變化，作者進(jìn)行了轉錄組測序。對差異基因進(jìn)行分析發(fā)現了許多與致病相關(guān)的基因，如WRKY、谷胱甘肽-轉移酶(GST)、乙烯反應因子(ERF)和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine-protein kinase)，這些都已經(jīng)被研究證實(shí)與防御反應相關(guān)。GO富集分析顯示，參與催化活性、抗氧化活性、免疫系統過(guò)程和刺激響應的差異基因發(fā)生了顯著(zhù)富集（圖9）。
圖9：GO富集分析結果
4、lmd體內過(guò)氧化物積累
許多LMM壞死病變的形成都與ROS相關(guān)。為了確定lmd的程序性細胞死亡是否伴隨著(zhù)活性氧的產(chǎn)生，作者進(jìn)行了DAB染色和DCFH-DA染色，結果顯示lmd體內積累了較多的過(guò)氧化物（圖10）。
圖10：DAB染色與DCFH-DA染色結果
5、lmd突變體對Alternaria alternata（煙草赤星病菌）具有較強抗性
研究發(fā)現類(lèi)病變突變體增強了對病原菌的抗性，為了測試lmd突變體是否對Alternaria alternata有抗性，作者將孢子懸浮液噴灑在NT、oe21和lmd幼苗上。7天之后，NT和oe21感染嚴重，出現了幾片枯萎葉片，而在lmd突變體中觀(guān)察到的枯萎葉片很少，盡管其葉片上有許多病變（圖11）。噴施17天后，NT和oe21的發(fā)病率均在90%以上，但lmd仍未出現感染葉片。lmd的發(fā)病時(shí)間出現在噴灑后22天，而此時(shí)，lmd的發(fā)病率為45.55%，但NT和oe21的發(fā)病率均為100%（圖12）。
圖11：感染Alternaria alternata后NT、oe21、lmd的表型
圖12：發(fā)病率統計結果
6、揭開(kāi)lmd的廬山真面目
前面提到過(guò)，作者構建了21個(gè)BpGH3.5超表達株系，由于其他20個(gè)BpGH3.5株系沒(méi)有顯示與lmd相似的表型，因此lmd的表型不是BpGH3.5過(guò)表達的結果，而是與T-DNA插入有關(guān)。作者通過(guò)基因組重測序與TAIL-PCR證實(shí)lmd基因組上有兩個(gè)T-DNA插入位點(diǎn)，其中一個(gè)插入位點(diǎn)位于BpEIL1啟動(dòng)子區域，導致BpEIL1表達水平顯著(zhù)下降，這可能是導致lmd出現類(lèi)病變表型的主要原因。
創(chuàng )新點(diǎn)
類(lèi)病變突變體在水稻、玉米、擬南芥等植物中研究較多，但在木本植物中卻鮮有報道，本研究通過(guò)轉錄組手段研究了樺樹(shù)lmd突變體產(chǎn)生類(lèi)病變表型的分子機制，為進(jìn)一步研究木本植物類(lèi)病變基因提供了基礎。
讀后感
故事到這就結束了，讀完這篇文章后，小編最大的感想就是“無(wú)心插柳柳成蔭”，偶然獲得的超表達株系表現出獨特的表型，并借用轉錄組與生理實(shí)驗的手段，作者解開(kāi)了圍繞在lmd身上的神秘面紗。突然想起了一句話(huà)，千萬(wàn)別擔心生物學(xué)沒(méi)有科研方向，隨便一個(gè)坑就能給你一條路！年關(guān)將至，各位奮斗在科研路上的大咖們，您的年終匯報準備的咋樣了？
參考文獻
Li R, Chen S, Liu G, Han R, Jiang J. Characterization and Identification of a woody lesion mimic mutant lmd, showing defence response and resistance to Alternaria alternate in birch. Sci Rep. 2017 Sep 12;7(1)
楊瑞丨文案
吳戈宇 | 審核
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