多組學(xué)聯(lián)合分析解析斑馬魚(yú)尾鰭位置記憶組織再生新視角

        組織再生需要細胞根據其所在空間位置調控自我更新和分化。位置記憶能使具有再生能力的細胞從未受傷的組織獲得空間信息。目前，科學(xué)家們認為位置記憶是依賴(lài)于某些信號分子的梯度，但有關(guān)它們的信息卻很少被揭示。在這篇文章中，作者以成年斑馬魚(yú)魚(yú)尾為研究模型，并沿著(zhù)空間軸（近端，中部，遠端）對未受傷魚(yú)尾的轉錄組、蛋白質(zhì)組和代謝組以及造模后魚(yú)尾的蛋白組進(jìn)行了定量分析。

 

材料與方法

1、實(shí)驗材料：
(1)轉錄組測序：
對沿尾鰭近遠中軸三個(gè)位置的每個(gè)位置進(jìn)行RNA-seq；近端，中間和遠端，每個(gè)樣本5個(gè)生物學(xué)重復，總計15個(gè)樣本。
(2)蛋白組測序：
實(shí)施了三次獨立的生物實(shí)驗以量化在未損傷鰭中沿近軸軸線(xiàn)的蛋白質(zhì)表達。
實(shí)驗1：收集并匯集來(lái)自八只年齡匹配的魚(yú)的近端和遠端區域。
實(shí)驗2：收集并匯集來(lái)自20只年齡和性別匹配的魚(yú)的背腹和腹側 – 遠側區域。
實(shí)驗3：收集并匯集了來(lái)自20只年齡匹配和性別匹配的魚(yú)的近端，中間和遠端區域。中間區域僅在實(shí)驗3中被采樣。
(3)代謝組測序：
分別收獲近端，中間和遠端區域來(lái)自六只成年魚(yú)（三只雄性和三只雌性）。
2、實(shí)驗方法：Illumina 測序；LC-MS；Label Free
3、研究策略：轉錄組、蛋白組、代謝組

研究結果

????????為了鑒定可能參與尾鰭位置記憶的候選分子，本研究對未受傷的斑馬魚(yú)尾鰭的近端，中間和遠端區域進(jìn)行了RNA測序(RNA-seq)和無(wú)標記定量(LFQ)蛋白質(zhì)組學(xué)(圖1A)，共鑒定出566個(gè)轉錄本和238個(gè)蛋白質(zhì)，主要存在于近或遠的富集梯度中(圖1B)。另外，主成分分析(PCA)顯示鰭的近端和遠端區域之間的轉錄物(圖1C)和蛋白質(zhì)(圖1D)豐度的變化很大。中間區域的轉錄本聚集成一個(gè)獨特的組，但更接近于遠端區域(圖1C)。差異豐富分子的最大差異發(fā)生在近端和遠端區域之間，包括1,424個(gè)轉錄本和113個(gè)蛋白質(zhì)(圖1E)。因此，基因組的表達在整個(gè)尾鰭的近遠端軸上存在著(zhù)定量的差異。

Fig.1. Transcriptomic and proteomic mapping of positional information in uninjured caudal fins.

圖1 無(wú)損傷尾鰭位置信息的轉錄和蛋白質(zhì)組學(xué)圖譜

        為了確定沿尾鰭近遠端軸線(xiàn)差異表達的分子類(lèi)型，因此對RNA-seq數據進(jìn)行了GO分析(圖2A)。轉錄因子是細胞識別的主要監管者，因此是位置記憶效應物的最佳候選者。在作者的RNA-seq數據中編碼轉錄因子的693個(gè)mRNA中，有53個(gè)在尾鰭前緣和末端區域差異表達(圖2B)。對應于964個(gè)跨膜受體中的80個(gè)和222個(gè)離子通道蛋白中的55個(gè)的RNAs在近端和遠端區域之間差異表達。這些命中包括谷氨酸和多巴胺可吸收G蛋白偶聯(lián)受體和幾個(gè)Ca2+和K+可滲透通道(圖2C和D)。此外，作者發(fā)現與先前不涉及生長(cháng)控制或再生的細胞信號傳導途徑相關(guān)的跨膜蛋白的差異表達，如ephrin和ednrab。RA，WNT和FGF信號傳導等幾種途徑在附肢發(fā)育和再生期間已知在生長(cháng)控制和圖案化中的作用，這些信號通路分別包含55，52和41個(gè)基因，并確定了12個(gè)RA，13個(gè)WNT和10個(gè)FGF信號傳導途徑基因相反的轉錄梯度(圖2E-G)。

Fig.2. Complex differential expression of RNAs identified along proximodistal axis of caudal fin.

圖2 沿著(zhù)尾鰭近端軸識別的RNAs的差異表達

        除了遺傳編碼的線(xiàn)索之外，代謝產(chǎn)物可能有助于位置記憶。另外還發(fā)現，幾種代謝酶沿尾鰭的近端軸線(xiàn)差異表達，包括aldh1l1。此外，近期富集蛋白的GO分析鑒定出與氨基酸代謝和脂質(zhì)轉運有關(guān)的蛋白質(zhì)(圖3A)。使用質(zhì)譜法分析未損傷尾鰭的近端，中間和遠端區域的代謝物，單個(gè)魚(yú)鰭樣品中共定量出125種代謝物。PCA將近端和遠端魚(yú)鰭區域的代謝物富集聚集成不同的組(圖3B)。幾種代謝產(chǎn)物的豐度在近端和遠端區域之間存在差異；26個(gè)近端富集，16個(gè)遠端富集(圖3C)。

Fig.3. Metabolites are differentially expressed along the proximodistal axis of the fin.

圖3 在鰭的近遠端軸上差異表達的代謝產(chǎn)物

        為了檢驗這種預測，分別于截肢后1、3天(dpa)，在blastema形成期和生長(cháng)期(圖4A）對再生鰭的片段進(jìn)行LFQ蛋白質(zhì)組學(xué)研究。為了減少魚(yú)類(lèi)之間的潛在變異，作者從同一條魚(yú)中采集了再生鰭的背側和腹遠端區域(雙截肢)。作者發(fā)現3061種蛋白質(zhì)中有97種、11種和2種在0，1和3dpa的背側和腹側-遠側位置之間差異表達。在再生過(guò)程中不同時(shí)間蛋白質(zhì)表達的PCA顯示1和3dpa的樣品聚集成不同的組，在近端或遠端區域之間幾乎沒(méi)有變化，而在未損傷的鰭(0dpa)中近端和遠端區域之間存在更多變異(圖4B)。然而，在1dpa差異表達的11種蛋白中，6種在未受損魚(yú)鰭(0dpa)中也差異表達。編碼這些蛋白質(zhì)的三個(gè)基因aldh1l1，hsd17b7和muc5.2(圖4C)也通過(guò)RNA-seq測量發(fā)現在未受傷的鰭片中差異表達。UniProt ID F1R4E4的一種無(wú)特征蛋白質(zhì)，是唯一在0，1和3dpa差異表達的蛋白質(zhì)(圖4D)。

Fig.4. Proteomic analyses of proximal and distal regions of regenerating caudal fins identifies proteins that maintain differential expression after injury.

圖4 對再生尾鰭近端和遠端區域的蛋白質(zhì)組學(xué)分析確定損傷后維持差異表達的蛋白質(zhì)

總結

        位置記憶賦予再生組織兩個(gè)關(guān)鍵屬性。首先，離身體近端的截肢比遠端截肢的再生更快。第二，新的組織是有圖案的。只有損傷部位遠端的結構才能再生。雖然相當多的研究集中在了解不同的生物體是如何開(kāi)始再生的，并且計算模型已經(jīng)預測了位置信息如何調節再生生長(cháng)，然而關(guān)于位置記憶的細胞機制知之甚少。

        跨膜受體Prod1是位置記憶唯一真正的效應者。除Prod1外，小分子維甲酸(RA)也被報道為兩棲類(lèi)肢體位置記憶的效應物。盡管有關(guān)Prod1和RA的這些數據，但沒(méi)有調節位置記憶的分子，在未受傷的附肢中表現出輕微的表達，并且在物種間保守。普遍假設預測位置記憶機制的分子梯度存在于未受傷的附肢中。因此，本研究測定了沿著(zhù)成年斑馬魚(yú)尾鰭近遠軸軸線(xiàn)的RNAs，蛋白質(zhì)和代謝物的全局豐度，鑒定了許多不同的圖案分子。這些信息為再生生物學(xué)領(lǐng)域提供了豐富的資源。通過(guò)一個(gè)復雜的成魚(yú)組織的一個(gè)軸的基因產(chǎn)物和代謝物的全局模式，并揭示位置記憶的候選效應器。候選物列表提供了一種潛在的標記物和效應因子，它們在成年附肢的再生和器官大小控制中起著(zhù)至關(guān)重要的作用。

        在脊椎動(dòng)物中，在附肢再生期間適當的圖案化受位置記憶的調節一種細胞特性假定依賴(lài)于未受傷肢體中分子的梯度。只有一個(gè)基因，蠑螈專(zhuān)用，已被證明可以調節位置記憶，并在未受傷的肢體中以梯度表達。確定新的候選人。

        作者繪制了未受傷的斑馬魚(yú)尾鰭上RNAs，蛋白質(zhì)和代謝物的豐度。作者確定了數百個(gè)分子梯度，并產(chǎn)生了32個(gè)基因和42個(gè)代謝物的高信度列表，這些斑馬魚(yú)是位置記憶的候選效應子。此外，這里發(fā)現的表達模式可能有助于解釋如何在復雜的成人組織中保持尺寸穩態(tài)和圖案。

 

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