草莓為什么這么甜？

代謝組學(xué)是目前用于作物改良的新興技術(shù)之一。它使人們對復雜的生物過(guò)程網(wǎng)絡(luò )有了一個(gè)全面的理解，這無(wú)疑有助于理解生物過(guò)程的復雜網(wǎng)絡(luò )，可持續加快作物生產(chǎn)。代謝組學(xué)優(yōu)勢包括能夠研究整個(gè)代謝物譜的變化，了解不同代謝物的作用和調節，從而導致增產(chǎn)、非生物和生物脅迫耐性、抗病性、種子組成和風(fēng)味豐富。

代謝物的改變同時(shí)也影響個(gè)體表型的變化，因此，代謝物可以當做一種“微觀(guān)”表型，并利用大量的分子標記對其進(jìn)行QTL定位，我們稱(chēng)之為mQTL（metabolome Quantitative Trait Locus，代謝數量性狀基因座）。

mQTL目前多應用于擬南芥、水稻、小麥、番茄[1-4]等蔬菜作物，近期圖譜君在碼文獻的時(shí)候發(fā)現一篇今年剛發(fā)表的多年生草本果樹(shù)mQTL案例，馬上就想跟大家分享一下，主要內容就是利用草莓種內構建F1群體結合初級代謝產(chǎn)物以及品質(zhì)性狀的表型進(jìn)行QTL和mQTL共定位，找到糖、酸和Vc候選基因。

 

研究背景

草莓是世界上最重要的軟果作物之一，其品質(zhì)在很大程度上取決于果實(shí)的成熟過(guò)程。在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中，花托在生長(cháng)素的的刺激下經(jīng)歷了分裂、膨脹和成熟階段，從而積累了糖、有機酸和揮發(fā)物。因此，成熟草莓因其獨特風(fēng)味而受到高度重視，同時(shí)其也是糖、礦物質(zhì)、維生素和抗氧化化合物的重要來(lái)源。

提高果實(shí)營(yíng)養品質(zhì)和感官品質(zhì)是目前草莓育種計劃的一個(gè)重要目標，本研究利用F1群體研究草莓果實(shí)初級代謝相關(guān)代謝性狀的變異和遺傳控制。

材料與方法

材料：八倍體草莓，“232”和“1392”進(jìn)行種內雜交得到F1群體，每個(gè)親本或F1分別種植6株（營(yíng)養繁殖）

性狀：2年表型（2013和2014年），初級代謝產(chǎn)物、維生素（L-AA）和關(guān)鍵果實(shí)品質(zhì)性狀（可溶性固形物SSC、可滴定酸TA以及PH）

表型測量：2013和2014年連續在春/秋中旬中同一天收獲熟果，每行收20-25個(gè)完全成熟的果實(shí)并混成3次生物學(xué)重復，用GC-MS檢測和半定量初級代謝產(chǎn)物

標記開(kāi)發(fā)：DArT 測序開(kāi)發(fā)的SNP和SSR標記，參考基因組為F. vesca v4.0.a1

圖譜構建及QTL定位：JoinMap 4.1和MapQTL 5.0的rMQM算法

表達分析：qRT-PCR（2個(gè)親本及10個(gè)子代）和RNA-seq（分別混合8個(gè)LAA高的個(gè)體和8個(gè)LAA低的個(gè)體，三次生物學(xué)重復）

代謝分析：雙親及F1群體果實(shí)中相對代謝物含量

結果與分析

1、表型分析

雖然利用Shapiro–Wilk 測驗，所有代謝產(chǎn)物的表型分布并不都是正態(tài)分布，但是其在子代群體均呈現連續變異，表明其為數量性狀。

2、代謝分析

對2013和2014年的層序聚類(lèi)分析，發(fā)現F1群體變異范圍超過(guò)雙親，且分為近似相等的3大類(lèi)，分別為糖及糖衍生物（A類(lèi)）、氨基酸（B類(lèi)）和多種化合物（C類(lèi)）。并將2年的代謝數據進(jìn)行了相關(guān)性分析，發(fā)現2年中2個(gè)季節的極顯著(zhù)相關(guān)（P<0.05）

圖1、代謝分析結果

3、mQTL定位

得到含有2089個(gè)標記，33條連鎖群的遺傳圖譜，總長(cháng)為2489 cM ，平均圖距為1.34cM，其中33條連鎖群對應草莓基因組的28條染色體。利用2007、2008和2009年的果實(shí)品質(zhì)性狀（SSC、L-AA和TA和PH）和2年代謝表型均值進(jìn)行QTL定位和mQTL定位。47個(gè)性狀定位到133個(gè)獨有的QTL位點(diǎn)。

圖2 QTL和mQTL定位結果

4、聯(lián)合分析

糖相關(guān)QTL和mQTL結果聯(lián)合分析，在LG V的13-26cM內找到同時(shí)控制蔗糖和棉子糖的位點(diǎn)（qSuc-V-4和 qRaf-V-4），位于草莓基因組chr5的1,822,882–7,927,246 bp，含有1097個(gè)基因。通過(guò)注釋發(fā)現，12個(gè)與糖的生物合成、代謝或運輸相關(guān)的基因。根據前人研究結果，選定7個(gè)基因用于qRT-PCR分析。qRT-PCR分析發(fā)現FvH4_5g03890基因表現出顯著(zhù)差異。

酸相關(guān)QTL和mQTL結果聯(lián)合分析，在LG V的18.18-25.6cM內找到控制琥珀酸的QTL位點(diǎn)（qSa-V-4），通過(guò)注釋找到FvH4_5g09730基因，但其表達無(wú)差異。但由于與糖定位結果存在交集，有可能是一因多效。

圖3 表達分析結果

5、L-AA候選基因Mannose-6-P-isomerase

通過(guò)本實(shí)驗之前的研究定位結果和mQTL定位結果聯(lián)合，在LG V的38.6-48.8 cM上找到一個(gè)與L-AA相關(guān)的QTL位點(diǎn)qLAA-V-1，位于chr5的8,160,286-13,129,181 bp，含有732個(gè)基因，通過(guò)注釋找到2個(gè)相關(guān)基因FvH4_5g20650和FvH4_5g21090（Mannose-6-P-isomerase）。利用F1的2個(gè)混樣RNA結果驗證FvH4_5g21090（FaM6PI1）為候選基因，并利用qRT-PCR驗證進(jìn)行了驗證。

圖4 表達分析結果

總結

本文利用F1群體構建遺傳圖譜，對50種初級代謝產(chǎn)物及主要果實(shí)品質(zhì)性進(jìn)行QTL和mQTL定位，聯(lián)合分析分別鎖定與控制糖、酸和L-AA相關(guān)的候選基因，然后利用RNA-seq和qRT-PCR進(jìn)行候選基因的驗證。其實(shí)看起來(lái)也比較簡(jiǎn)單，但是勝在表型的多樣化及多年數據，其實(shí)存在困難的地方在于群體的代謝物測量，還有可測量代謝物的種類(lèi)，有些物質(zhì)的標準品還是很難弄到的，本文只測量了初級代謝物，如果也能測量次級代謝物那就更好了，多維度考查表型，從而揭示某一個(gè)性狀的調控機制已成為目前主流手段。

 

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參考文獻：

1. Lisec J , Meyer R C , Steinfath M , et al. Identification of metabolic and biomass QTL in Arabidopsis thaliana, in a parallel analysis of RIL and IL populations[J]. Plant Journal, 2007, 53(6):960-972.

2. Matsuda F , Okazaki Y , Oikawa A , et al. Dissection of genotype–phenotype associations in rice grains using metabolome quantitative trait loci analysis[J]. The Plant journal : for cell and molecular biology, 2012, 70(4):624-636.

3.Detection of QTL for metabolic and agronomic traits in wheat with adjustments for variation at genetic loci that affect plant phenology[J]. Plant Science, 2015, 233:143-154.

4.Tieman D, Zhu G, Resende M F R, et al. A chemical genetic roadmap to improved tomato flavor[J]. Science, 2017, 355(6323): 391-394.

5.Vallarino J G, Pott D M, Cruz-Rus E,et al. Identification of quantitative trait loci and candidate genes for primary metabolite content in strawberry fruit[J].Horticulture Research,2019,6:4?

doi: 10.1038/s41438-018-0077-3

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