scRNA-seq助力解析馬間充質(zhì)基質(zhì)細胞的功能異質(zhì)性

 

研究背景

幾十年來(lái)，利用間充質(zhì)基質(zhì)細胞(MSCs)的組織工程和再生醫學(xué)被認為在各種疾病的臨床應用前景廣闊，然而，大量的表型和功能的批次之間的差異阻礙了基礎研究和臨床應用的效率和可重復性（Arezoo?et?al.，?2017，Arezoo?et?al.，?2018，Wei?et?al.，?2018）。MSC治療的療效被認為取決于從不同組織來(lái)源分離的MSC培養物和從同一組織來(lái)源分離的MSC的異質(zhì)性，MSC異質(zhì)性通常通過(guò)形態(tài)學(xué)、表面標記物的表達、細胞動(dòng)力學(xué)、分化潛能和選擇基因表達模式來(lái)評估（Ho?et?al.，?2008，Meirav?et?al.，?2011）。單細胞RNA測序(scRNA-seq)是一種用于解剖細胞異質(zhì)性的強大工具（Barrett?et?al.，?2019），但是到目前為止，還沒(méi)有關(guān)于供體匹配的組織來(lái)源的小鼠間充質(zhì)基質(zhì)細胞的scRNA-seq數據的報道（Zhou?et?al.，?2019），為了克服從不同組織來(lái)源收集供者匹配的間充質(zhì)基質(zhì)細胞的實(shí)際障礙，馬是很好的模型。

美國康奈爾大學(xué)獸醫學(xué)院貝克動(dòng)物健康研究所Van?de?Walle研究團隊于2020年12月4日在Stem?Cell?Research?&?Therapy上發(fā)表了解析MSC異質(zhì)性的研究進(jìn)展。文章利用了scRNA-seq等技術(shù)探索三個(gè)不同組織來(lái)源（AT、BM、PB）的原代馬間充質(zhì)基質(zhì)細胞的源間和源內異質(zhì)性，并確定了檢測到的轉錄差異與細胞運動(dòng)和免疫調節功能的表型變異相對應，這將提高M(jìn)SC?治療潛力，加速其從實(shí)驗室到臨床的過(guò)渡。

研究方法

在本研究中，作者從健康成年溫血母馬的脂肪組織（AT）、骨髓（BM）和外周血（PB）3種組織中分離出MSCs，基于scRNA-seq檢測到的轉錄差異，進(jìn)行了功能實(shí)驗以檢查不同MSC群體的運動(dòng)和免疫調節功能。

研究結論

來(lái)自三個(gè)不同組織來(lái)源的MSC培養物之間連接粘附分子2（JAM2）的差異表達轉化為BM來(lái)源的MSC的細胞運動(dòng)性改變?；

來(lái)自相同組織來(lái)源的克隆MSC系中CXCL6表達的差異與PB衍生的MSCs的化學(xué)吸引能力相關(guān)。

實(shí)驗材料

材料：從健康成年溫血母馬的脂肪組織（AT）、骨髓（BM）和外周血（PB）3種組織中收集初生馬間充質(zhì)基質(zhì)細胞(MSCs?)，無(wú)生物學(xué)重復，共計3個(gè)樣本。

方法：scRNA-seq，siRNA敲除，RT-PCR，Western?blotting，細胞增殖、粘附測定，細胞侵襲和遷移實(shí)驗，細胞克隆和細胞趨化實(shí)驗

研究結果

1.?scRNA-seq數據揭示了從供體匹配的組織來(lái)源分離的MSCs的來(lái)源間變異

從健康成年溫血母馬的脂肪組織（AT）、骨髓（BM）和外周血（PB）3種組織中收集初生馬間充質(zhì)基質(zhì)細胞(MSCs?)，共3個(gè)樣本，并根據它們分化成脂肪細胞、軟骨細胞和骨細胞的潛力以及細胞蛋白的表達模式進(jìn)行表征實(shí)驗，幾乎沒(méi)有觀(guān)察到MSCs的源間或源內變化(Fig.?1a(i))。對來(lái)自骨髓，脂肪和外周血組織的MSCS進(jìn)行流式細胞儀檢測，?結果顯示MSC標記基因ITGB1、CD44、THY、ENG和B2M基因在每個(gè)組織中都有大多數細胞表達（Fig.?1a(ii)）?；?0x?genomic平臺進(jìn)行了scRNA-seq分析，scRNA-seq數據進(jìn)一步證實(shí)了流式細胞儀結果(Fig.?1b)。為了進(jìn)一步揭示了MSCs的來(lái)源間變異，作者分析了三種組織來(lái)源的所有scRNA-seq數據，采用無(wú)監督聚類(lèi)將細胞劃分為3個(gè)細胞亞群。聚類(lèi)結果顯示細胞主要是通過(guò)來(lái)源組織聚集在一起的，將不同樣本用不同顏色標出恰好得到每個(gè)cluster幾乎完全對應著(zhù)一個(gè)樣本(Fig.?2a)。熱圖顯示三個(gè)不同組織之間顯著(zhù)差異表達基因（DEGs）(Fig.?2b)，分別在A(yíng)T、BM和PB來(lái)源的骨髓間充質(zhì)基質(zhì)細胞中檢測到37、35和20個(gè)DEGs。對每個(gè)組織來(lái)源分離的MSC中前5個(gè)DEGs表達水平進(jìn)行小提琴圖展示(Fig.?2c)。

 

2.?連接粘附分子2（JAM2）調節骨髓間充質(zhì)基質(zhì)細胞的細胞運動(dòng)表型

scRNA-seq結果發(fā)現，JAM2相對于PB衍生的MSCs和AT衍生的MSCs，在BM衍生的MSCs中的表達水平顯著(zhù)更高(Fig.?2c)，作者在組間顯著(zhù)差異表達的基因里邊挑選出了連接粘附分子2（JAM2），JAM2基因編碼JAM-2/JAM-B蛋白，有研究表明JAM-2在擴散、粘附、遷移和入侵的各種過(guò)程中發(fā)揮作用，作者通過(guò)RT-PCR驗證了來(lái)自這三種不同組織來(lái)源的MSCs中JAM2的表達模式。為了探索JAM2在MSC生物學(xué)中的作用，作者首先測定來(lái)自供體匹配脂肪組織（AT）、骨髓（BM）和外周血（PB）的MSCs中細胞增殖率的基線(xiàn)測量(Fig.?3a(i))，細胞粘附力(Fig.?3a(ii))，細胞入侵能力(Fig.?3a(iii))，以及細胞遷移能力(Fig.3a(iv))。然后作者使用RNA干擾(RNAi)來(lái)降低BM衍生的MSCs中JAM2的表達并做對比實(shí)驗，結果發(fā)現敲除JAM2對BM來(lái)源的MSCs增殖沒(méi)有顯著(zhù)影響(Fig.?3b(i))，它也沒(méi)有改變粘附強度(Fig.?3b(ii))，但JAM2的敲除導致入侵能力增強(Fig.?3b(iii))，BM來(lái)源的MSCs遷移減少(Fig.3b(iv))，表明JAM-2調節BM來(lái)源的MSCs的細胞運動(dòng)表型?？偟膩?lái)說(shuō)，這些結果表明JAM2參與了BM衍生的MSCs的細胞侵襲和遷移。除了差異基因表達外，作者表明MSCs的源間異質(zhì)性轉化為生物學(xué)相關(guān)的MSC功能，例如與細胞運動(dòng)相關(guān)的功能。

3.?scRNA-seq數據揭示了從供體匹配組織來(lái)源分離的馬骨髓間充質(zhì)基質(zhì)細胞的來(lái)源內變異

無(wú)監督聚類(lèi)分別將AT來(lái)源的MSCs、BM來(lái)源的MSCs和PBM來(lái)源的MSCs聚類(lèi)為7，7，10個(gè)clusters(Fig.?4a)。根據作者最初的分析中，細胞周期相關(guān)基因的表達對聚類(lèi)有很大的影響（Kowalczyk?et?al.，?2015）。在本研究中作者也觀(guān)察到一些明顯由與增殖一致的基因表達模式定義的簇(Fig.?4b)，因此，作者進(jìn)一步分析了G1?clusters和G2M/S?clusters，以確定不同細胞周期分類(lèi)的簇間差異基因表達模式。在這種分組策略下，差異基因表達測試顯示來(lái)自AT、BM和PB衍生的MSCs中存在明顯的源內轉錄異質(zhì)性，盡管在A(yíng)T來(lái)源的MSCs中差異較小，差異表達基因?(DEGs)?以熱圖的形式進(jìn)行展示?(Fig.?5)。為了檢查檢測到的clusters的假定生物學(xué)功能，作者對每個(gè)組織中的每個(gè)cluster進(jìn)行了GO功能富集分析，其中BM來(lái)源的MSCs中排名最靠前的是cluster2的細胞遷移和cluster3中的慢性炎癥反應，PB來(lái)源的MSCs中排名靠前的是cluster4的蛋白組折疊和cluster6中的趨化性調節，AT來(lái)源的MSCs沒(méi)有檢測到任何顯著(zhù)富集的GO?terms，表明檢測到的clusters之間的轉錄差異極小。

4.?PB衍生MSC的克隆異質(zhì)性揭示了趨化能力的功能差異

在PB-MSC和BM-MSC分析中顯著(zhù)富集的GO?terms中，作者注意到與細胞遷移和趨化性相關(guān)的功能。作者使用體外限制性稀釋細胞克隆試驗來(lái)產(chǎn)生克隆的PB衍生MSC系，用于下游功能性趨化性試驗，探索MSC趨化活性可能的功能源內變異。根據scRNA-seq分析結果，從單個(gè)PB來(lái)源的MSCs中產(chǎn)生14個(gè)克隆細胞系，并通過(guò)RT-PCR評估各種趨化相關(guān)基因的表達。作者發(fā)現?C-X-C?基序趨化因子配體?6?(CXCL6)，一種參與粒細胞募集的分子，相對于其他克隆，在克隆?5?中的表達水平顯著(zhù)更高(Fig.?6a)，這與scRNA-Seq檢測PB-MSC群體中少數細胞中CXCL6的表達一致(Fig.?6b-d)。將骨髓間充質(zhì)基質(zhì)細胞添加到帶有3μm孔插入物的transwell板的下孔中，該孔插入物接種有馬中性粒細胞。作者觀(guān)察到，與CXCL6?low?MSCs相比，CXCL6?hi?MSCs刺激中性粒細胞遷移到顯著(zhù)更高的水平，而大量原始MSC培養刺激中性粒細胞遷移到中等水平(Fig.?6e)。當使用從?CXCL6hi?MSC?收集的條件培養基（CM）進(jìn)行這些實(shí)驗時(shí)，觀(guān)察到了類(lèi)似的結果(Fig.?6f)，表明骨髓間充質(zhì)基質(zhì)細胞對趨化性的影響不需要直接接觸細胞。

這些結果表明，MSCs中的CXCL6表達水平與體外增加的中性粒細胞遷移相關(guān)，并提供了概念驗證，即PB衍生的MSCs中的源內異質(zhì)性轉化為生物學(xué)相關(guān)功能，例如與免疫調節相關(guān)的功能。

總結

本研究首次使用scRNA-seq技術(shù)來(lái)比較從單個(gè)供體的3個(gè)不同組織來(lái)源分離的間充質(zhì)基質(zhì)細胞?(MSCs)?的表達譜，單細胞分辨率下的基因表達譜表明，來(lái)自不同組織來(lái)源的MSCs在轉錄上是不同的，來(lái)自同一組織來(lái)源的MSCs也表現出基因表達的差異。來(lái)自三個(gè)供體匹配組織來(lái)源的MSC培養物之間JAM2的差異表達轉化為BM衍生的MSCs的細胞運動(dòng)性改變，證明JAM2調節BM來(lái)源的MSCs的細胞運動(dòng)表型。此外，來(lái)自相同組織來(lái)源的克隆MSC系中CXCL6表達的差異與PB衍生的MSCs的免疫調節功能相關(guān)。綜上，單細胞轉錄組學(xué)數據可以為功能研究提供理論基礎，更好地了解賦予MSC特定治療有益特性的細胞異質(zhì)性以及開(kāi)發(fā)捕獲和擴展具有這些特性的特定MSCs的方法。這些進(jìn)展將加速MSC治療從基礎醫學(xué)的工作臺轉移至臨床。

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參考文獻：

Harman?RM，?Patel?RS，?Fan?JC，?Park?JE，?Rosenberg?BR，?Van?de?Walle?GR.?Single-cell?RNA?sequencing?of?equine?mesenchymal?stromal?cells?from?primary?donor-matched?tissue?sources?reveals?functional?heterogeneity?in?immune?modulation?and?cell?motility.?Stem?Cell?Res?Ther.?2020?Dec?4;11(1):524.

doi:?10.1186/s13287-020-02043-5.

PMID:?33276815;

PMCID:?PMC7716481.