上一次，小編帶大家一起看了兩棲動(dòng)物蠑螈神奇的斷肢再生。那么，是否有水生動(dòng)物也具有強大的再生能力呢？今天就為各位老師分享一篇關(guān)于斑馬魚(yú)心臟再生的單細胞&時(shí)空組學(xué)文章。
發(fā)表期刊：Nature Genetics
發(fā)表單位：柏林醫學(xué)系統生物學(xué)研究所
影響因子：41.307
發(fā)表時(shí)間：2022.07.21
DOI號：10.1038/s41588-022-01129-5
研究背景
成年哺乳動(dòng)物的心臟損傷通常會(huì )導致永久性瘢痕。然而，成年斑馬魚(yú)心臟損傷后能有效再生，這使得斑馬魚(yú)成為研究心臟再生細胞和分子機制的理想模型。在模擬心肌梗塞的低溫損傷后，受傷的斑馬魚(yú)心臟會(huì )經(jīng)歷一個(gè)短暫的纖維化期。在此期間，受損的心肌會(huì )通過(guò)去分化和增殖進(jìn)行再生，這與心肌梗死的某些方面相似。然而，在以往的斑馬魚(yú)心臟再生研究中，還沒(méi)有系統的數據來(lái)確定再生細胞的狀態(tài)和細胞類(lèi)型的起源，對再生生態(tài)位的細胞組成、潛在的信號傳遞和相互作用的認識仍不全面。目前對活化巨噬細胞和成纖維細胞的定義嚴重依賴(lài)于轉基因，可能受到觀(guān)察偏差的影響，從而低估斑馬魚(yú)心臟再生過(guò)程中細胞狀態(tài)的復雜性。
材料方法
單細胞RNA-seq ：
表1 實(shí)驗樣本一覽表
空間轉錄組（Tomo-seq）：斑馬魚(yú)心房和心室一共100張切片，每張切片分別做RNA-seq
方法：scRNA-seq、Tomo-seq、熒光原位雜交和基于CRISPR-Cas9技術(shù)的譜系追蹤
研究結果
為了系統地識別健康和再生斑馬魚(yú)心臟中的細胞類(lèi)型，作者對損傷前后不同階段的大約20萬(wàn)個(gè)解離細胞進(jìn)行了scRNA-seq（圖1a）。為了準確得到細胞發(fā)育起源的相關(guān)信息，作者還應用了一種基于CRISPR–Cas9技術(shù)的大規模平行譜系追蹤方法，通過(guò)注射Cas9和針對多拷貝轉基因(斑馬魚(yú)系中的dTomato：一種用于斑馬魚(yú)細胞追蹤和譜系分析的多光譜細胞標記)的sgRNA，創(chuàng )建了作為譜系條形碼的“遺傳疤痕”來(lái)記錄早期發(fā)育中的譜系關(guān)系。
作者首先評估了健康和再生心臟中的細胞類(lèi)型多樣性，單細胞轉錄組的聚類(lèi)分析顯示了所有主要的心臟細胞類(lèi)型。正如預期的那樣，觀(guān)察到成纖維細胞和免疫細胞在損傷后強烈增加（圖1b）。進(jìn)一步檢查聚類(lèi)數據發(fā)現，心臟的三個(gè)主要層:心外膜、心肌和心內膜的細胞類(lèi)型之間存在一個(gè)亞結構。作者假設，由于心房和心室中這些細胞類(lèi)型的功能差別，這種細胞類(lèi)型的亞結構可能存在空間差異。于是使用Tomo-seq方法（一種用冷凍切片機沿感興趣的軸對組織進(jìn)行切片，然后在每個(gè)切片上進(jìn)行RNA-seq的技術(shù)）進(jìn)行空間分辨率轉錄組，并將空間數據解卷積為單細胞轉錄譜，可以驗證一些細胞亞型在心房和心室富集（圖1c）。之后再通過(guò)物理分離心房和心室，使用scRNA-seq證實(shí)了這一發(fā)現（圖1d）。
圖1?再生心臟的細胞組成
作者進(jìn)一步確定了心肌細胞中的一個(gè)轉錄亞結構（圖2a）。除了以表達ATP合成和三羧酸循環(huán)相關(guān)基因(atp5pd和aldoaa)為特征的成年心肌細胞外，還檢測到一個(gè)較小的與心肌細胞發(fā)育相關(guān)的基因簇(ttn.1, ttn.2,?bves and synpo2lb)，以及nppa——此前已被證明是邊界區去分化心肌細胞的標記基因。這些去分化心肌細胞是心臟再生的標志，其數量在3 d.p.i.（受傷后天數）增加了(圖2a)，并與已建立的標記基因nppa22部分共定位于7 d.p.i.。
作者注意到心臟再生中三個(gè)成熟的信號因子在成纖維細胞中高度富集:合成視黃酸的酶aldh1a2、心肌細胞有絲分裂原nrg1和再生細胞外基質(zhì)(ECM)因子fn1a（圖2b）。為了更詳細地研究心臟成纖維細胞的多樣性，作者對成纖維細胞進(jìn)行了亞群聚類(lèi)。結果顯示出驚人的多樣性，有13個(gè)轉錄上不同的成纖維細胞聚類(lèi)(圖2c)。這13個(gè)基因簇在ECM相關(guān)基因的表達譜上表現出明顯的差異（圖2d），但它們的轉錄組多樣性遠不止于此——去除ECM相關(guān)基因后，可以高精度鑒定相同的成纖維細胞亞型。
圖2?心臟成纖維細胞的細胞類(lèi)型多樣性
3. 心臟再生成纖維細胞的鑒定
為了集中分析那些可能是再生生態(tài)位一部分的成纖維細胞亞型，作者分析了損傷后細胞簇的動(dòng)力學(xué)。col11a1a、col12a1a和nppc特征表達的3簇成纖維細胞在再生高峰期短暫出現?(3、 7 d.p.i.)，但在受傷前和再生完成后幾乎不存在。由于其短暫性，作者將這三個(gè)基因簇稱(chēng)為細胞狀態(tài)，而不是細胞類(lèi)型（圖3a）。為了對鑒定的成纖維細胞進(jìn)行空間分辨，作者進(jìn)行了熒光原位雜交證實(shí)了瞬時(shí)成纖維細胞狀態(tài)在邊界區以及損傷區的位置（圖3b）。之后發(fā)現nrg1在col12a1a成纖維細胞中特別高的表達，而fn1a幾乎只在col11a1a成纖維細胞中表達（圖3c）。作者推斷瞬時(shí)細胞狀態(tài)的潛在再生功能可能是由分泌因子驅動(dòng)的。生物信息學(xué)分析顯示，與未損傷的對照組心臟相比，再生心臟的分泌組基因表達在3 d.p.i.和7 d.p.i.時(shí)增加（圖3d）。col11a1a和col12a1a成纖維細胞中分泌組基因的表達在所有檢測到的細胞簇中最高，且其分泌組基因包含在再生、形態(tài)發(fā)生和組織發(fā)育等方面具有功能的基因（圖3e）。
雖然作者對單細胞基因表達譜的時(shí)空分析強烈表明了瞬時(shí)成纖維細胞的再生功能，但還需要額外的實(shí)驗來(lái)驗證這一假設。為了從功能上評估瞬時(shí)col11a1a和col12a1a成纖維細胞的作用，作者使用硝基還原酶/甲硝唑（NTR/MTZ）系統進(jìn)行靶向細胞剔除。在MTZ處理后的轉基因系Tg(-4kbcol12a1a:GAL4VP16;UAS:NTR:RFP)中，在7 d.p.i.時(shí)相較于對照，5 / 6的心臟顯示心肌細胞增殖減少，col12aa表達細胞減少（圖3g,h）。在30d.p.i.時(shí)，col12a1+細胞剔除顯著(zhù)損害心臟再生（圖3i,j）?？傊?，作者確定了心臟再生過(guò)程中具有潛在再生作用的三種成纖維細胞狀態(tài):col11a1a、col12a1a和nppc成纖維細胞?；蚣毎蕹龜祿娏冶砻?em>col12a1a表達細胞在再生生態(tài)位中發(fā)揮了作用。
圖3?心臟再生成纖維細胞的鑒定
4. 心外膜成纖維細胞的鑒定
接下來(lái)，作者想要闡明短暫成纖維細胞狀態(tài)的起源，以便更好地理解它們的激活機制。于是作者使用了基于CRISPR-Cas9技術(shù)的大規模平行譜系追蹤方法LINNAEUS。這種方法將細胞通過(guò)可遺傳的DNA條形碼(遺傳疤痕)標記，它們由Cas9在早期發(fā)育過(guò)程中產(chǎn)生，其獨特的序列能夠識別疤痕產(chǎn)生時(shí)來(lái)自同一親本的細胞。通過(guò)對同一個(gè)單細胞的遺傳疤痕和轉錄組進(jìn)行測序，作者便可以建立譜系樹(shù)，揭示這些細胞類(lèi)型的共同發(fā)育起源（圖4a）。在譜系樹(shù)中，一個(gè)節點(diǎn)中的所有細胞共享相同的發(fā)育祖先（比如圖4a，B和C節點(diǎn)就共享相同發(fā)育祖先A），并且每個(gè)節點(diǎn)上不同瞬時(shí)細胞狀態(tài)下的每個(gè)細胞均可在相同的上一節點(diǎn)中對應找到（比如在圖4a的譜系圖中節點(diǎn)C就包含了3種瞬時(shí)細胞狀態(tài)，這三種狀態(tài)下的所有細胞均可以在上一節點(diǎn)的對應細胞狀態(tài)中找到）。作者還計算了不同樹(shù)節點(diǎn)中細胞類(lèi)型比率之間的相關(guān)性，以確定哪些細胞類(lèi)型通過(guò)譜系相關(guān)聯(lián)（圖4b）。譜系相關(guān)性聚類(lèi)熱圖顯示，在3 d.p.i.時(shí)有4簇細胞類(lèi)型，在7 d.p.i.時(shí)有7簇細胞類(lèi)型。在這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，所有的免疫細胞共享一個(gè)相同的譜系。此外，幾種成纖維細胞：col11a1a、col12a1a和構成型成纖維細胞，它們和心外膜細胞聚集在一起，這表明這些成纖維細胞與心外膜細胞具有共同的發(fā)育起源（圖4c,d）。為了驗證這一結論，作者又構建了轉基因系TgBAC(tcf21:Cre-ERT2;ubi:Switch)。重組后，在7 d.p.i.表達的mCherry與內源性表達的col12a1a共定位（圖4e），證實(shí)了瞬時(shí)col11a1a和col12a1a成纖維細胞為心外膜或心外膜衍生成纖維細胞的起源。為了進(jìn)一步闡明短暫心外膜成纖維細胞狀態(tài)的起源，作者應用了RNA速度分析方法，對心外膜譜系簇中所有心室細胞類(lèi)型在3 d.p.i.和7 d.p.i.下的發(fā)育軌跡進(jìn)行推斷（圖4f），得到了相同的結論。
圖4?心外膜成纖維細胞的鑒定
5. 心內膜成纖維細胞的鑒定
瞬時(shí)nppc成纖維細胞和其他幾個(gè)成纖維細胞亞型(spock3、cfd和瓣膜成纖維細胞)在3 d.p.i.或7 d.p.i.時(shí)不屬于心外膜譜系，但與心內膜以及彼此之間顯示中度正相關(guān)?；谙嚓P(guān)性的分析有一個(gè)潛在的假設，即所有克隆體都會(huì )表現出相似的轉換率（圖5a），但是這種假設并不適用于所有細胞類(lèi)型，于是作者引入條件概率開(kāi)發(fā)了第二種算法（圖5b）。在3 d.p.i.時(shí)，不同成纖維細胞類(lèi)型：col11a1a成纖維細胞、構成型成纖維細胞、心外膜(心室)轉變?yōu)?em>col12a1a成纖維細胞類(lèi)型的條件概率均大于0.9（圖5c）。在7 d.p.i. 時(shí)，不同的心內膜細胞類(lèi)型：心內膜（心房）、心內膜（心室）和心內膜 ( frzb )轉變?yōu)?em>nppc成纖維細胞的條件概率均大于0.8，表明這種成纖維細胞類(lèi)型與心內膜之間存在譜系關(guān)系。為了驗證算法的真實(shí)性，作者構建了轉基因系Tg(fli1:Cre-ERT2; hsp70l:Switch)。在7 d.p.i.表達的EGFP與內源性表達的nppc共定位（圖5e），證實(shí)了瞬時(shí)nppc成纖維細胞的心內膜起源。RNA速度分析揭示了心室內膜和nppc成纖維細胞之間的轉錄相似性和潛在的過(guò)渡路徑（圖5f）。從單細胞轉錄組數據中觀(guān)察到，與健康對照組心臟相比，心內膜在7 d.p.i.時(shí)發(fā)生了激活反應（圖5g）。
圖5?心內膜成纖維細胞的鑒定
6. 典型Wnt信號通路作用的細胞解剖
作者發(fā)現成纖維細胞中表達了許多與Wnt信號有關(guān)的基因(配體、受體和調節劑)（圖6a），于是這啟發(fā)了他們去研究Wnt信號在斑馬魚(yú)心臟再生過(guò)程中的作用。一方面，Wnt通常被認為是一種促增殖因子，Wnt的激活已被證明對斑馬魚(yú)鰭和脊髓再生有益。另一方面，Wnt信號通路在心肌細胞去分化和增殖中的作用存在爭議。于是，作者在斑馬魚(yú)心臟冷凍損傷后，使用特征良好的Wnt/β-catenin依賴(lài)的信號抑制劑IWR-1抑制典型的Wnt信號，并在3,7,15和30 d.p.i.觀(guān)察其影響。結果發(fā)現，Wnt/β-catenin信號通路抑制導致心臟再生顯著(zhù)延遲，與對照組相比，心肌纖維化延長(cháng)，損傷面積增大（圖6b）。IWR-1處理后心臟的單細胞轉錄組數據顯示心肌細胞去分化延遲，與對照組相比，去分化心肌細胞數量在3 d.p.i.時(shí)減少，而在7 d.p.i.時(shí)未定位于損傷區域（圖6c）。Wnt抑制后，血管周細胞和所有心內膜成纖維細胞(nppc、spock3和瓣膜成纖維細胞)的水平顯著(zhù)降低，而其他短暫增加的成纖維細胞總體上保持在類(lèi)似水平（圖6d）。通過(guò)熒光原位雜交也證實(shí)了，Wnt信號對于心內膜成纖維細胞的激活是必需的，類(lèi)似于所描述的Wnt在誘導小鼠內皮細胞向間充質(zhì)細胞轉化中的作用。
為了評估血管再生，作者對4d.p.i.下冠脈內皮細胞(cECs)的增殖以及7 d.p.i.損傷區冠狀動(dòng)脈的覆蓋范圍進(jìn)行了定量分析。發(fā)現注射IWR-1后，cEC增殖在4 d.p.i.時(shí)有邊緣但不顯著(zhù)的下降（圖6f,g）。然而，在7d.p.i.時(shí)，損傷區冠狀動(dòng)脈覆蓋明顯減少（圖6h,j）。這些結果表明，Wnt抑制后觀(guān)察到的心臟再生減少至少部分是由血管再生缺陷介導的。這種缺陷似乎不是由cECs增殖減少引起的，而可能與血管再生的其他方面有關(guān)。
圖6 對典型Wnt信號作用的細胞剖析
總? 結
成年斑馬魚(yú)心臟損傷后具有很高的再生能力。然而，再生生態(tài)位的組成在很大程度上仍然難以捉摸。這篇文章基于單細胞轉錄組學(xué)和時(shí)空分析，解剖了再生斑馬魚(yú)心臟中激活細胞狀態(tài)的多樣性。觀(guān)察到損傷后出現的幾種具有成纖維細胞特征的瞬時(shí)細胞狀態(tài)，并概述了表達膠原-12的成纖維細胞的促再生功能。為了了解導致心臟再生的級聯(lián)事件，作者通過(guò)高通量譜系追蹤確定了這些細胞狀態(tài)的起源。最終發(fā)現激活的成纖維細胞有兩個(gè)不同的來(lái)源:心外膜和心內膜。在機制上，確定Wnt信號作為心內膜成纖維細胞反應的調節器?？傊?，本文確定了促進(jìn)心臟再生的特殊活化成纖維細胞狀態(tài)，從而為調節脊椎動(dòng)物心臟再生能力開(kāi)辟了可能的途徑。
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