在單細胞轉錄組測序實(shí)驗中，需要從各種樣本中制備單細胞懸液，針對不同的樣本類(lèi)型，如何獲取活性高、完整性好、結團率低的單細胞懸浮液，是單細胞實(shí)驗成功與否的關(guān)鍵所在。下面就分享從動(dòng)物組織、血液、植物組織三種樣本中獲取單細胞懸浮液的基本制備方法和注意事項。
一、動(dòng)物組織
動(dòng)物組織由細胞外基質(zhì)和嵌入細胞外基質(zhì)的細胞組成，且細胞和細胞之間存在著(zhù)大量的蛋白質(zhì)，例如增強組織強度和韌性的膠原蛋白、彈性蛋白等；促使細胞和外基質(zhì)結合的層黏連蛋白、纖黏連蛋白等。一般需要通過(guò)機械法或者酶解法得到單細胞懸浮液。
不同的組織類(lèi)型需要不同的解離酶混合液，目前常用的有膠原酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等，將動(dòng)物組織解離成單細胞懸浮液。根據具體組織類(lèi)型選擇對應的酶或酶的組合進(jìn)行解離。
動(dòng)物組織解離需要注意：
1、細胞離開(kāi)母體后很脆弱，解離過(guò)程中酶混合液配比、酶濃度、離心速度、孵育溫度、緩沖液等都可能影響細胞活性。
2、對于難解離的樣本，需要優(yōu)化解離酶混合液的配比和延長(cháng)解離時(shí)間。
3、新鮮的組織才能用于單細胞懸浮液的制備，若是冰凍動(dòng)物組織建議提取細胞核。
4、組織解離過(guò)程中，若細胞碎片過(guò)多，會(huì )大大降低細胞的捕獲效率。
二、血液樣本
外周血單核細胞(Peripheral blood monoculear cell, PBMC)中大部分都是淋巴細胞（包括B細胞和T細胞)，以及少部分的自然殺傷細胞和單核細胞，而紅細胞和血小板沒(méi)有細胞核，而粒細胞(granulocytes) 包括中性粒細胞、嗜堿性粒細胞和嗜酸性粒細胞，有多葉核，所以不包括在PBMC中。PBMC的制備采用密度梯度離心法，可通過(guò)Ficoll作為密度梯度介，使得不同密度的細胞在對應的界面處，然后通過(guò)快速離心，實(shí)現細胞分離。
圖1. Ficoll分離細胞的原理效果圖（圖片來(lái)自于網(wǎng)絡(luò )）
制備PBMC需要注意：
1、全血分離人PBMC，血液樣本置于EDTA紫色抗凝管中保存，4℃保存不超過(guò)12h。
2、需緩慢將血液加在Ficoll上層，速度過(guò)快可能會(huì )沖破層界。
3、使用前需要將Ficoll溶液先恢復至室溫，再進(jìn)行后續實(shí)驗。
4、搜集得到的樣本若還含有大量的紅細胞，需要進(jìn)行二次裂紅處理。
三、植物組織
近年來(lái)，關(guān)于人和動(dòng)物的單細胞轉錄組測序應用越來(lái)越廣泛，植物單細胞研究相對滯后且應用領(lǐng)域范圍較小。因為與動(dòng)物細胞相比，植物細胞多了一層細胞壁，阻礙了植物單細胞懸浮液的制備。一般需要通過(guò)酶解法將植物組織制備成原生質(zhì)體，例如用纖維素酶以及果膠酶消化植物細胞壁的主要成分（纖維素、半纖維素、果膠等）。
原生質(zhì)體制備需要注意：
1、幼嫩的組織，比如根尖、嫩葉等，細胞壁比較容易被酶消化。成熟或衰老組織需更長(cháng)酶解時(shí)間，以便增加原生質(zhì)體的獲得率。
2、為了提高原生質(zhì)體的制備率，建議PH的范圍維持在5.6～6.0。
3、一般選用0.4M的甘露醇穩定劑來(lái)維持滲透壓的平衡。
4.對于一些難制備原生質(zhì)體的植物樣本，可以考慮提取植物細胞核。
最后，制備合格的單細胞懸浮液/原生質(zhì)體/細胞核樣本，可以直接通過(guò)百創(chuàng )DG1000單細胞微液滴系統，實(shí)現高通量的單細胞精準捕獲。百創(chuàng )DG1000是基于微流控、油滴包裹和Barcode標記等技術(shù)來(lái)實(shí)現高通量的細胞捕獲。除了儀器以外，百創(chuàng )DG1000還有配套的2×4的獨立芯片及配套試劑盒。
百創(chuàng )DG1000部分數據展示
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