常見(jiàn)醫學(xué)樣品RNA提取制備方法

核酸（nucleic acid）在生物界中堪稱(chēng)主宰，是一類(lèi)非常重要的生物大分子，它在生物的繁衍、發(fā)育、維持、衰老和死亡等一切生命活動(dòng)中扮演著(zhù)重要的角色，如果其結構出現稍許的變動(dòng)，比如一個(gè)堿基的差錯、缺失或增加，就有可能導致突變、缺陷或疾病的出現，所以核酸已成為生物化學(xué)、遺傳學(xué)以及其他有關(guān)生命學(xué)科的熱門(mén)研究課題，其覆蓋面之廣、進(jìn)展之速為其他學(xué)科所望塵莫及。而進(jìn)行核酸研究的第一個(gè)前提就是能夠將核酸從眾多紛繁復雜的生物大分子中提取出來(lái)，并純化到一定程度，以便進(jìn)行相應的科學(xué)研究和實(shí)際應用。
核酸，快到“管”里來(lái)共分六期，通過(guò)此系列與大家分享核酸提取樣品制備、提取方法及檢測方面的知識，以期能夠對大家的科研有所幫助。

1.全血樣品

01.采血管選擇
采集血液進(jìn)行檢測面臨的一個(gè)主要問(wèn)題就是細胞內RNA的不穩定性，RNA在采血后數小時(shí)內便會(huì )迅速降解。此外，某些種屬的RNA在采血后會(huì )通過(guò)基因誘導在體外增加。體外RNA降解和基因誘導均可導致體內相關(guān)基因的轉錄本數目低估或高估。
BD公司的PAXgene血液RNA管內含能夠穩定體內基因轉錄性狀的添加劑，它能夠減少體外RNA的降解，并將基因誘導的水平降低到最小程度，適用于人和靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物全血樣品制備，對于全血樣品，我們只推薦使用此管送樣。

BD PAXgene血液RNA管（貨號762165）

02.采集血液
使用PAXgene血液RNA管前請仔細閱讀產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，以便進(jìn)行正確的操作。如果PAXgene血液RNA管為唯一的抽血管，則將血液抽入PAXgene血液RNA管之前應先抽血入“廢棄管”內，使抽血過(guò)程中所用的采血器內能被血液預灌注；否則PAXgene血液RNA管應為抽血程序中的最后一只試管。確保血液已停止流入試管再從持針器上取下試管（PAXgene血液RNA管內的負壓設計可向管內抽2.5ml的血）。

采血后應立即將PAXgene血液RNA管輕輕地顛倒8-10次，以確保管內保護劑和血液充分混合均勻。

03.保存、運輸
將PAXgene血液RNA管豎直置于室溫（18-25℃）靜置2-24小時(shí)，之后可貯藏于-20℃或更低溫度；若試管要貯藏于低于-20℃的溫度，先在-20℃冷凍24小時(shí)，然后再將其轉移到-70℃或-80℃，可保存至少50個(gè)月。大體積干冰運輸。

2.血清血漿樣品

由于細胞內含有的RNA的豐度遠高于血液中游離的RNA，即使極少量細胞的存在也會(huì )對血液中游離RNA的分析造成很大影響。故去除細胞和細胞碎片的污染是血清血漿樣品制備過(guò)程的關(guān)鍵。

01.采血管選擇
對于血清樣品，使用普通血清真空采血管即可；對于血漿樣品，推薦使用EDTA抗凝管，禁止使用肝素類(lèi)抗凝管。

02.血漿樣品的分離、保存
使用EDTA抗凝管采集血液樣品（采集后的血液樣品可置于室溫或4℃短暫保存，但不得超過(guò)1h）。1900g（或3000rpm），4℃，離心10min。小心轉移上層血漿（黃色）至新的1.5ml離心管中，槍頭不要觸碰中間層（白細胞和血小板層）。一般情況下，10ml的血液可分離出4-5ml血漿。將分離出的血漿16000g，4℃，離心10min。槍頭不要觸碰到管底一側的雜質(zhì)，小心轉移上清到一個(gè)新的1.5ml離心管中，-80℃保存。大體積干冰運輸。

血漿樣品分離

03.血清樣品的分離、保存
使用含凝血激活劑的采血管或普通真空采血管采集血液樣品，室溫靜置10-60min使血液凝集。1900g（或3000rpm），4℃，離心10min。小心轉移上層血清（黃色）至新的1.5ml離心管中，槍頭不要觸碰中間層（白細胞和血小板層）。一般情況下，10ml的血液可分離出3-5ml血清。將分離出的血清16000g，4℃，離心10min。槍頭不要觸碰到管底一側的雜質(zhì)，小心轉移上清到一個(gè)新的1.5ml離心管中，-80℃保存。大體積干冰運輸。

血清樣品分離

3.細胞上清

使用合適的容器收集細胞培養液或其他生物液體。3000g，4℃，離心15min。小心轉移上清液至新的無(wú)菌離心管中。將分離出的細胞上清液16000g，4℃，離心10min。槍頭不要觸碰到管底一側的雜質(zhì)，小心轉移上清到新的無(wú)菌離心管中，-80℃保存。大體積干冰運輸。

細胞上清分離

4.外泌體樣品

對于老師自己富集好的外泌體，需要將外泌體溶解在不大于100ul RNase-free的PBS中并充分混勻，以方便后面提取。外泌體樣品溶液置于-80℃保存。大體積干冰運輸。

5.組織樣

用于提取RNA的醫口組織樣，如果樣品量較小，建議優(yōu)先選擇保護液（RNAlater等）送樣方式。

方案一、保護液送樣（RNAlater等）
用解剖刀將新鮮組織切成長(cháng)寬高均≤0.5 cm的樣本，小器官如鼠肝、腎和脾可以完整的保存在RNAlater中。將組織樣本浸入5-10倍體積的 RNAlater中，以使組織完全浸沒(méi)。將樣本置于4℃孵育過(guò)夜（以使 RNAlater 完全滲透組織），然后轉移至-80 ℃長(cháng)期保存。大體積干冰運輸。

方案二、液氮速凍送樣
取下新鮮組織，立即剔除結締組織和脂肪組織等非研究所需的組織類(lèi)型，如果組織體積較大，應盡量將組織切成長(cháng)寬高均≤0.5 cm 的小塊（即黃豆大?。?。迅速用預冷的PBS溶液（RNase free）或生理鹽水將組織表面的殘留血液沖洗干凈。將處理好的組織樣本混合均勻后保存于旋蓋的液氮預冷凍存管中。迅速置于液氮中冷凍約3h，然后轉移至-80 ℃長(cháng)期保存。大體積干冰運輸。

注意事項：
1.對于RNA類(lèi)項目的癌癥樣品，我們建議手術(shù)取下的組織迅速放入RNAlater中，4℃孵育24小時(shí)，然后棄掉RNAlater，切下壞死區的組織以及癌旁組織，轉入旋蓋的液氮預冷凍存管中，液氮速凍，-80℃保存，干冰運輸。
2.組織樣品離開(kāi)活體后，建議在3min內進(jìn)行液氮速凍，速凍前操作時(shí)間越長(cháng)，RNA降解的可能性越大。
3.組織樣不建議使用TRIzol送樣，如必須，需充分液氮研磨后溶于適量TRIzol中，組織樣品切勿過(guò)量，常溫裂解5min后，-80低溫凍存，干冰運輸。

6.細胞樣品

一次RNA提取反應所需細胞數≤1×10^7個(gè)，以3×10^6—1×10^7個(gè)為宜。樣品量較大的話(huà)，建議按上述要求將細胞樣品分裝至不同的管中。

01.貼壁細胞
從培養箱中取出貼壁培養的細胞，顯微鏡下觀(guān)察細胞，確定生長(cháng)狀態(tài)良好（正常細胞融合度在80 %左右）。棄去培養基，向細胞培養瓶或培養皿中加入5mL PBS（RNase-free，室溫）洗一次。棄盡PBS，加入適量TRIzol，反復吸打數次；直至看不見(jiàn)成團的細胞塊，使之充分溶解于裂解液中形成清亮不粘稠的液體。將裂解好的細胞溶液轉移至 1.5 mL 旋蓋離心管（ RNase-free ）中，置于-80 ℃長(cháng)期保存，大體積干冰運輸。

02.懸浮細胞
首先要確定細胞生長(cháng)狀態(tài)良好；離心得到細胞沉淀（依據客戶(hù)實(shí)驗室細胞離心步驟，注意細胞離心要適度，不要使細胞離心過(guò)實(shí)而造成裂解液不能充分滲透）。棄去培養基，加入 1 mL PBS（RNase free，室溫），輕輕將細胞沉淀懸起， 轉移至2 mL 旋蓋尖底離心管（RNase free）中。離心（依據客戶(hù)實(shí)驗室細胞離心步驟，注意細胞離心要適度，不要使細胞離心過(guò)實(shí)而造成裂解液不能充分滲透）得到細胞沉淀，棄去PBS，加入適量TRIzol中，反復吸打數次，直至看不見(jiàn)成團的細胞塊，使之充分溶解于裂解液中。置于-80 ℃長(cháng)期保存，大體積干冰運輸。

注意事項：
1.如果是DNA項目普通滅菌PBS清洗即可，如果是RNA項目必須是RNAse-free的。
2.獲取細胞不建議用胰蛋白酶處理，胰酶為蛋白，如果有殘留的話(huà)會(huì )影響后續實(shí)驗。
3.細胞數量低于5×105建議速凍直接送樣（不用裂解液裂解），由于細胞數少，我們會(huì )安排微量提取。
4.細胞類(lèi)樣品不建議保存于RNAlater類(lèi)組織RNA保護液中送樣，因為RNAlater密度大，保存于其中的細胞難于再離心收集用于提取。

本篇完結，有才的小編突發(fā)奇想，愿以本篇軟文的角度賦詩(shī)一首，送給有緣的你：

你看，或者不看我
我就在這里
不來(lái)不去
你懂，或者不懂我
我就在這里
不悲不喜
我愿意住進(jìn)你的心里
默然，相助
悄然，歡喜
愿你科研順利

分子實(shí)驗中心 畢經(jīng)德 | 文案
吳爽 | 審核
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