4個(gè)全長(cháng)轉錄組研究案例解讀

從1977年第一代測序技術(shù)的問(wèn)世，發(fā)展至今已有四十余年，這幾十年間，測序技術(shù)的發(fā)展突飛猛進(jìn)，從一代到二代再到三代，每一步突破都是測序行業(yè)一次質(zhì)的飛躍。三代測序以PacBio公司的SMRT測序技術(shù)為代表，測序過(guò)程無(wú)需PCR擴增，再加上三代測序長(cháng)讀長(cháng)的優(yōu)勢，無(wú)需組裝，可以直接獲得從5’端到3’端高質(zhì)量的全長(cháng)轉錄組信息，可準確鑒定基因的可變剪接、APA（可選擇性多聚腺苷酸化）、融合基因、基因家族和非編碼RNA等信息。百邁客2016年率先引進(jìn)三代測序平臺PacBio RSⅡ和PacBio Sequel，至今已積累了豐富的項目經(jīng)驗，無(wú)論實(shí)驗能力還是信息分析能力都達到行業(yè)較高水平。一定不是小編吹噓，咱們用事（案）實(shí)（例）說(shuō)話(huà)。

案例一：

Identification and analysis of glutathione S-transferase gene family in sweet potato reveal divergent GST-mediated networks in aboveground and underground tissues in response to abiotic stresses
通過(guò)鑒定和分析谷胱甘肽S轉移酶基因家族揭示甘薯地上和地下組織響應非生物脅迫中的GST介導的網(wǎng)絡(luò )調控機制
發(fā)表雜志：BMC Plant Biology
影響因子：3.964
發(fā)表時(shí)間：2017
實(shí)驗材料：甘薯
測序方法：2+3聯(lián)合測序
文章概述：基因重復是物種進(jìn)化研究的重要內容之一?；蛑貜涂梢詫е禄蛟诰幋a蛋白以及表達量上的多樣性，并最終導致明顯的功能分化。某個(gè)基因家族可能是由同一個(gè)祖先（全基因組或單個(gè)基因）通過(guò)基因重復分化而來(lái)。谷胱甘肽S-轉移酶（GSTs）是一類(lèi)基因家族，其廣泛真核生物和原核生物中。GST基因可以參與到生物體響應非生物脅迫中（如臭氧、過(guò)氧化氫、植物激素、重金屬、熱激、干旱等）。甘薯是六倍體物種，其復雜的遺傳背景被認為是多個(gè)物種的全基因組重復形成的。本文通過(guò)2+3轉錄組測序技術(shù)進(jìn)行基因家族分析。發(fā)現GST基因廣泛參與甘薯的非生物脅迫相應中，且層次聚類(lèi)分析表明GST基因的在甘薯地上和地下組織中響應非生物脅迫的表達模式明顯不同。

圖1. 甘薯、野生甘薯、擬南芥、牽?；℅ST蛋白系統進(jìn)化樹(shù)

案例二

SMRT sequencing of full-length transcriptome of flea beetle Agasicles hygrophila (Selman and Vogt)
蓮草直胸跳甲全長(cháng)轉錄組分析
發(fā)表雜志：Scientific reports
影響因子：4.259
發(fā)表時(shí)間：2018年1月
實(shí)驗材料：蓮草直胸跳甲
測序方法：2+3聯(lián)合測序
文章概述：空心蓮子草Alternanthera philoxeroides (Mart.) (Amaranthaceae)是多年生雜草，原產(chǎn)于南美洲，20世紀30年代傳入我國。在中國空心蓮子草被認為是一種重要入侵物種，并且嚴重影響了農業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境。蓮草直胸跳甲Agasicles hygrophila是空心蓮子草的專(zhuān)性天敵，作為生物防治手段而被引入。目前，蓮草直胸跳甲的基因組和轉錄組信息尚未被研究，因此在本研究中作者對其進(jìn)行了全長(cháng)轉錄組測序，獲得較完整的轉錄本集合，預測了145個(gè)可變剪接事件；27,318條簡(jiǎn)單重復序列，經(jīng)TransDecoder鑒定獲得24,040個(gè)ORF，其中有16,205個(gè)完整的ORF；預測得到4,198 個(gè)lncRNA，為進(jìn)一步研究蓮草直胸跳甲與宿主植物和生態(tài)系統之間相互作用的分子機制提供了很好的遺傳信息基礎。

圖2. 蓮草直胸跳甲轉錄本的GO功能注釋

案例三

Generation and comparative analysis of full-length transcriptomes in sweetpotato and its putative wild ancestor I. trifida
甘薯及野生型甘薯的全長(cháng)轉錄組比較分析
發(fā)表雜志：暫無(wú)開(kāi)源期刊，冷泉港實(shí)驗室在線(xiàn)發(fā)表
發(fā)表時(shí)間：2017年3月
實(shí)驗材料：甘薯和野生甘薯
測序方法：2+3聯(lián)合測序
文章概述：甘薯是許多發(fā)展中國家最重要的作物之一，也是重要的能量來(lái)源。然而，甘薯是同源六倍體植物，基因組大小約3-4G，目前還沒(méi)有高質(zhì)量的參考基因組。此外，甘薯基因組的雜合度高，目前還沒(méi)有關(guān)于甘薯正向遺傳學(xué)研究的報道。目前，沒(méi)有獲得大規模的全長(cháng)cDNA序列阻礙了甘薯功能基因組學(xué)和分子育種研究的進(jìn)展。長(cháng)期以來(lái)，人們一直認為甘薯最有可能由二倍體祖先野生甘薯（I. trifida）進(jìn)化而來(lái)，但是沒(méi)有確鑿的證據。該研究通過(guò)2+3聯(lián)合測序的方法獲得甘薯和野生甘薯的全長(cháng)轉錄本，揭示二者的進(jìn)化關(guān)系。甘薯和野生甘薯大多數的轉錄本都是同源的，并且確定了1269個(gè)假定的甘薯和野生甘薯之間的同源基因對，通過(guò)Ka/Ks比值分析，只有56個(gè)基因對的Ka/Ks比值大于1，表明在甘薯的進(jìn)化或馴化過(guò)程中，大多數基因都是受到純化選擇的。

圖3. 在甘薯（Ib53861）和野生甘薯（It51184）中的53,861個(gè)非冗余轉錄物的數量和長(cháng)度分布。

案例四

A transcriptome atlas of rabbit revealed by PacBio single-molecule long-read sequencing
通過(guò)PacBio單分子長(cháng)讀長(cháng)測序技術(shù)揭示家兔轉錄本圖譜
發(fā)表雜志：Scientific reports
影響因子：4.25
發(fā)表時(shí)間：2017
實(shí)驗材料：兔子
測序方法：2+3聯(lián)合測序
文章概述：兔子（Oryctolagus cuniculus），是重要的哺乳動(dòng)物，由于其與人類(lèi)系統發(fā)育關(guān)系密切，并且具有生命周期短、性格溫順等特點(diǎn)，因此在生物醫學(xué)研究中將兔子作為模式動(dòng)物。兔子的基因組大小為2.66Gb，從Ensembl數據庫預測到22，668個(gè)基因位點(diǎn)包括了24,946個(gè)轉錄本，但是其中的大部分只是預測，不同的isoforms和非翻譯區還缺少可靠的注釋?zhuān)瑢碗s的轉錄本評估不準確，通過(guò)高通量測序的方法可以較好的研究轉錄本、isoforms和基因表達水平，但是由于二代測序的短讀長(cháng)很難獲得轉錄本全長(cháng)，研究可變剪接和APA事件就成為問(wèn)題，本研究利用PacBio三代測序平臺，共鑒定到多達24,797個(gè)AS事件和11,184個(gè)APA事件，提供了一整套全面的轉錄本參考數據集，用于繪制兔的轉錄本圖譜。對于改進(jìn)兔基因組的注釋有較大幫助。

Figure 4.基因通過(guò)PacBio所測轉錄本和組裝得到的轉錄本還原10個(gè)MHC基因。染色體定位、命名和每個(gè)基因的Ensembl編號（在左側）

 

我們都知道好的測序數據要配上專(zhuān)業(yè)的分析團隊才能讓故事敘述的更加完美，百邁客研發(fā)團隊于2018年5月在之前的分析基礎上新增了一些分析條目，讓您的數據抒寫(xiě)更華麗的篇章（如下表）。

百邁客全長(cháng)轉錄組分析流程圖：

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