快速克隆基因（二）

 

Positional cloning 2.0?怎樣避免在基因克隆上花費10年？

 

就像Xa21的克隆，圖位克隆一直是基因定位的有效方法，它的關(guān)鍵在于產(chǎn)生高分辨率的作圖群體應用于表型鑒定和基因分型，這對親本和創(chuàng )建合適的群體要求較高。今天，隨著(zhù)測序技術(shù)、芯片技術(shù)的發(fā)展，開(kāi)發(fā)出“海量”的SNP標記，當分子標記密度不再是克隆基因中的絆腳石，我們得關(guān)注其它問(wèn)題并進(jìn)行解決。以下總結3點(diǎn)：

??加速基因克隆的方法1-縮短群體構建時(shí)長(cháng)

針對這個(gè)問(wèn)題，作者總結出以下幾點(diǎn)：

第一：構建DH系，由單倍體加倍獲得的雙單倍體，可直接用于育種，極大地縮短育種周期。

第二：Speed breeding，它是一種縮短作物生長(cháng)周期方法，采用了22:2小時(shí)的光：暗循環(huán)實(shí)現了大麥、小麥、豌豆等一年6代的生長(cháng)繁殖，對油菜每年可增長(cháng)至4代。近日，Nature Protocol發(fā)表了題為”Speed breeding in growth chambers andglasshouses for cropbreeding and model plant research”的研究論文，作者從光強、濕度、溫度及光周期等條件闡述了溫室中加速育種的方法，包括小麥、大麥、硬粒小麥、燕麥、蕓苔屬植物、豌豆、草豌豆、鷹嘴豆、二穗短柄草和藜麥等的快速生長(cháng)的條件。

將DH系和Speed breeding相結合可大大縮減構建群體的周期。

??加速基因克隆的方法2-候選區段基因組裝

一旦將基因定位至一段遺傳區間內，此時(shí)會(huì )涉及到遺傳距離向物理距離，CM向bp的轉化，這也是圖位克隆的限速步驟，在大基因材料中表現的更明顯，此前它涉及了多輪BAC文庫篩選，例如，小麥中數百個(gè)基因抗病基因被定位，而只有幾十個(gè)被克隆。每個(gè)BAC克隆含有100-200 kb的DNA，這樣，覆蓋小麥基因組需要500,000個(gè)BAC克隆，且三個(gè)高相似度的基因組為對我們的篩選進(jìn)行干擾，高質(zhì)量的參考基因組可部分克服這種困難，仍存在由于BAC克隆所含片段大小的限制，圖位克隆已100-200 kb的速度步移著(zhù)。如何解決這個(gè)問(wèn)題？

2017年Thind提出了‘Targeted chromosome-based cloning via long-range assembly’(TACCA)的方法，利用Illumina測序得到的短片段序列，對其組裝，比較片段差異。利用此方法，成功在小麥中克隆了小麥抗葉銹病基因Lr22a。

而Illumina讀長(cháng)短，百邁客引入ONT?測序（OxfordNanopore Technologies，簡(jiǎn)稱(chēng)ONT）平臺，部分項目的結果中，平均reads長(cháng)度幾乎均在20Kb以上（不同樣品DNA抽提難易程度不同，會(huì )造成一定的影響），最長(cháng)readsN50高達48.3 Kb，最長(cháng)Reads更是高達1.29 Mb！這為后期不用組裝，直接檢測定位區間內的變異提供可能。

??加速基因克隆的方法3-突變體創(chuàng )造

目前，研究單個(gè)基因和單個(gè)基因效應常用方法有誘導突變，DNA誘變劑包括物理誘變與化學(xué)誘變。跳躍基因，T-DNA的發(fā)現也為創(chuàng )造突變體提供新的方法。而人工誘變相較于自然突變有如下優(yōu)點(diǎn)：1、變異豐富，原則上可在基因的任何部位發(fā)生突變；2、單基因隱性突變體可直接研究表型與基因型的關(guān)系，從而排除背景基因對其影響；3、絕大多數誘變植物與未處理植物之間的表型變化由誘變基因控制。

TILLING，即Targeting Induced Local Lesions IN Genomes（定向誘導基因組局部突變技術(shù)），是由Steven Henikoff領(lǐng)導的研究小組發(fā)展起來(lái)的，TILLING技術(shù)借助高通量的檢測手段，快速有效地從由化學(xué)誘變劑(EMS)誘變過(guò)的突變群體中鑒定出點(diǎn)突變。目前此技術(shù)廣泛應用于作物研究中，另外還有基因全基因組重測序的MutMap和MutMap +方法，實(shí)現功能基因的快速定位。MutRenSeq和MutChromSeq也應用于突變基因定位，2016年John Innes Centre組織利用EMS誘變產(chǎn)生的小麥突變體，使用液相捕獲技術(shù)，通過(guò)特異性的RNA捕獲探針對目標區域進(jìn)行富集，二代測序后，通過(guò)比對野生型和抗性突變體的序列，找到了目標抗性基因。MutChromSeq在此基礎上進(jìn)行改進(jìn)，利用流式細胞儀技術(shù)將含目標基因的單條染色體分離出來(lái)，后期結合高通量測序，通過(guò)比較突變體及野生型的差異，快速克隆基因，此方法大大降低重測序的難度，減少了其它染色體序列對目標序列的影響。

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