植物生長(cháng)素受體TIR1的同源物（PagFBL1）可通過(guò)與Aux/IAA28互作調控楊樹(shù)不定根的生長(cháng)

在二代測序遍地開(kāi)花的時(shí)代，想發(fā)一篇高分的文章越來(lái)越難，今天，我們就來(lái)帶大家解析一篇成功案例，看看作者是如何利用普通二代轉錄組引領(lǐng)高分的~

研究背景

根在水和養分的獲取、維持植物地上生長(cháng)中起著(zhù)至關(guān)重要的作用。大多數單子葉植物和許多熱帶、溫帶濕樹(shù)林中存在天然的不定根。不定根形成的生物過(guò)程復雜多樣，按照時(shí)間階段可分為誘導、啟動(dòng)、根原基激活和生長(cháng)，不同階段均受到多種因素的影響，如遺傳背景、母本生理狀態(tài)、激素的應用和環(huán)境條件等。其中影響不定根發(fā)育的最重要的因子則為植物激素，而生長(cháng)素則起了決定性作用。近年來(lái)，在擬南芥上的生長(cháng)素對不定根的調控已經(jīng)取得了巨大的科研成果，其可通過(guò)生長(cháng)素信號網(wǎng)絡(luò )誘導不定根的萌發(fā)。研究表明，楊樹(shù)和擬南芥上對不定根的誘導和發(fā)育存在一定的相同點(diǎn)，但是將草本植物上不定根的研究成果應用于木本植物的可行性仍需要進(jìn)一步的研究。

材料方法

試驗材料：銀腺楊無(wú)性系84K（銀白楊X腺毛楊）的枝條

試驗內容：

1、ProPagFBL1::GUS試驗；構建過(guò)表達（OE）和干擾（KD）PagFBL1載體并轉染，培育轉基因植株，進(jìn)行表型測定

2、在不定根誘導的0，12，24和48 h采集莖部樣品，進(jìn)行轉錄組測序

3、雙分子熒光互補技術(shù)、酵母雙雜交實(shí)驗

測序平臺：北京百邁客生物科技有限公司?Illumina Hiseq 2500 PE125

研究結果

1、PagFBL1在不定根發(fā)育中具有時(shí)空表達差異

GUS信號在剪切后的0h主要在莖形成層和未成熟的木質(zhì)部存在，隨后在不定根誘導的2天后，越來(lái)越多的GUS信號聚集在形成層和次生韌皮部，3~4天，形成層、次生韌皮部和皮層的不定根原基細胞中出現GUS信號。在不定根誘導5天后，GUS信號在不斷增大的根原基逐漸降低并在第六天消失。結果表明，PagFBL1會(huì )參與不定根生成的初期階段，如誘導和萌生期，可參與生長(cháng)素信號通路從而調控不定根的誘導和萌生。

圖1、不定根生成時(shí)期PagFBL1的表達模式

2、在轉基因群體里過(guò)表達和干擾PagFBL1對不定根形成的影響

相較于野生型，過(guò)表達株系（OE）更早的出現了不定根且在不同時(shí)間點(diǎn)，其有不定根的莖葉所占比例更高，生根率達到100%的時(shí)間比野生型早6h。此外，OE植株的生根量也顯著(zhù)增加，且在土壤中種植5個(gè)月后，對其總根長(cháng)度、根面積和根的鮮重與干重進(jìn)行測定，發(fā)現OE植株含有更大的根系，且在使用IAA處理移植葉片后趨勢相同。在PagFBL1?KD株系，這種現象在使用IAA處理移植葉片后也是延遲出現的。此外，與OE和野生型的株系相比，KD的不定根的數量和生物量顯著(zhù)下降。結果表明，PagFBL1對楊樹(shù)不定根的形成有重要作用。

圖2、過(guò)表達、干擾和野生型植株不定根生成比較

3、過(guò)表達PagFBL1刺激轉基因楊樹(shù)基因表達的重塑

使用Illumina測序技術(shù)進(jìn)行轉錄組分析從而鑒定影響不定根生成的差異表達基因。不論在野生型還是過(guò)表達植株里，0h與12h的差異表達基因均多于12h vs. 24h和24h vs. 48h比較組。因此，在不定根誘導和萌發(fā)的前12h發(fā)生了大量基因的重塑。OE植株在前12h增加1518個(gè)差異表達基因，其中有119個(gè)基因在野生型的12h vs. 24h中出現（圖3）。這些結果表明，PagFBL1基因的高表達會(huì )增強促進(jìn)不定根形成的基因的表達變化。

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圖3、差異表達基因分析

隨后，對這些差異表達的基因進(jìn)行COG分析，發(fā)現在OE植株#18和野生型中，與其他時(shí)間點(diǎn)相比，在前12h，參與信號轉導的大量基因被激活。在#18植株中，前12h有大量的DEGs僅富集于植物激素信號轉導通路，其中有26.9%的差異表達基因富集到了生長(cháng)素通路中（圖4）。這些基因包括：5個(gè)細胞色素P450家族成員、1個(gè)Cullin-1 (CUL1)、7個(gè)E3泛素蛋白連接酶、4個(gè)26S蛋白酶體蛋白、2個(gè)IAA28家族、3個(gè)ARFs基因和3個(gè)GH3家族。利用qRT-PCR對這些基因的表達量進(jìn)行統計分析，發(fā)現其表達趨勢與RNA測序得到的RPKM趨勢相似。ARF5.1，ARF5.2，GH3.1和GH3.6?在不定根的誘導中高表達，其中在OE中表現的更明顯。在不定根誘導中參與IAAs和ARFs的結果表明在誘導和萌發(fā)期，生長(cháng)素可通過(guò)FBL1-IAA-ARF信號促進(jìn)不定根的形成。

圖4、差異表達基因功能聚類(lèi)分析

4、PagFBL1通過(guò)PagIAA28.1和PagIAA28.2作用生長(cháng)激素信號通路

使用雙分子熒光互補技術(shù)，將15個(gè)Aux/IAA基因共轉染到煙草葉片，發(fā)現只有在nYFP-PagFBL1與?cCFP-PagIAA28.1?和cCFP-PagIAA.28.2共轉染后（圖5a）才會(huì )發(fā)現YFP熒光蛋白信號，且生長(cháng)素濃度越高，信號越強，而在其他組合中，只發(fā)現了DAPI信號（圖5b）。

基于雙分子熒光互補研究結果，進(jìn)一步進(jìn)行酵母雙雜試驗。結果表明，PagFBL1和PagIAA28.1、PagIAA.28.2均有很強的結合，由此證明他們參與楊樹(shù)莖段不定根的誘導過(guò)程。

圖5、驗證試驗

亮點(diǎn)總結

1、好的試驗設計，是文章出彩的前提

2、故事一定要有完整性，環(huán)環(huán)相扣，由淺入深，才能吸人眼球

3、多種技術(shù)手段聯(lián)合應用，表型數據和測序數據相輔相成，互相印證，才能讓研究更具說(shuō)服力

 

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