RNA-seq&ATAC-seq揭示TRIM28參與HIV-1潛伏感染機制【成功案例】

2019年新年伊始，百邁客與中山大學(xué)中山醫學(xué)院合作發(fā)表了RNA-seq & ATAC-seq多組學(xué)文章，研究了人類(lèi)免疫缺陷病毒1型(HIV-1)潛伏感染的分子機制，文章發(fā)表在Elife雜志上，詳情如下：

研究背景

HIV-1潛伏感染是利用抑制性聯(lián)合抗逆轉錄病毒治療(combined antiretroviral therapy，cART)后實(shí)現治愈的一個(gè)主要障礙，其在體內存在病毒儲藏庫，需要終身的聯(lián)合抗逆轉錄病毒治療。潛伏感染的靜息CD4⁺?T細胞不能產(chǎn)生足以被免疫系統識別的病毒抗原，因此很難被根除。作為功能性治療策略之一的“shock and kill”策略已經(jīng)引入并在這些年中得到廣泛應用。然而，一些感染細胞含有非誘導型前病毒，其很難被LRA重新激活。進(jìn)一步闡明HIV-1潛伏期的機制將有助于我們更好地了解病毒儲藏庫的形成和維持，并開(kāi)發(fā)新的治療干預措施。

（“Shock and kill”即“先激活后絕殺”策略，是利用藥物激活潛伏在T細胞內的艾滋病毒使其暴露，隨后通過(guò)增強免疫系統或者抗病毒藥物消滅攜帶有病毒的宿主細胞。其中，“Shock”策略中很重要的就是潛伏期逆轉劑（Latency reversing agents，LRA）的研發(fā)；“kill”即對激活后的HIV病毒進(jìn)行殺傷，用的是用自體過(guò)繼免疫療法，如CTL反應和抗體依賴(lài)性細胞介導的細胞毒性作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）。）

表觀(guān)遺傳調控有助于建立和維持HIV-1潛伏感染：比如組蛋白脫乙酰酶、組蛋白甲基轉移酶等”writer”在HIV-1長(cháng)末端重復序列（LTR）上作抑制性表觀(guān)遺傳標記，由”reader”蛋白蛋白HP1γ和L3MBTL1進(jìn)一步維持；miR-28等microRNAs和NEAT1等lncRNA，這些非編碼RNA能夠靶向病毒RNA和病毒蛋白，以介導HIV潛伏感染的轉錄或轉錄后調控。

重新激活潛伏HIV-1的另一個(gè)障礙取決于轉錄控制：轉錄起始水平，HIV-1潛伏期由轉錄因子（包括NF-κB、Sp1、AP-1、NFAT和TFIIH）缺陷以及轉錄抑制因子（包括LSF、YY1和CTIP2）的積累所貢獻。然而，細胞周期蛋白Cyclin T1的表達在潛伏感染的細胞中下調，細胞周期蛋白依賴(lài)性激酶 CDK9也是無(wú)活性的。

雖然許多工作揭示了HIV-1潛伏期的表觀(guān)遺傳和轉錄調控機制，但仍存在一些重要問(wèn)題：1、可能有一個(gè)多功能因素負責這兩種機制；2、啟動(dòng)子近端暫停的機制尚未完全闡明3、P-TEFb如何被適當隔離、釋放并靶向HIV-1啟動(dòng)子；4、尚未找到能夠有效重新激活潛伏HIV-1的強大逆轉劑LRA。

研究方法

• siRNA文庫高通量篩選：鑒定HIV-1抑制和潛伏的細胞靶蛋白，TZM-BL細胞系（一種攜帶有熒光素酶報告基因的傳代細胞系,并且該報告基因受HIV-1 tat原件調控，只有在HIV-1 Tat蛋白存在的情況下才能有效表達。）
• RNA-seq：用PHA刺激來(lái)自?xún)蓚€(gè)健康供體的新鮮分離的CD4 + T細胞2天或不進(jìn)行處理，鑒定HIV-1潛伏相關(guān)基因
• ChIP實(shí)驗：TZM-bl和J-Lat 10.6細胞系鑒定TRIM28結合區域，以及后續各個(gè)組蛋白修飾或蛋白的chip鑒定
• SUMO-MS：TRIM28 SUMO化候選底物
• 蛋白功能閾缺失實(shí)驗：探究TRIM28的功能及重要功能域
• 共定位實(shí)驗：超分辨率的連續隨機光學(xué)重建顯微鏡（cSTORM）3D共定位及結構光顯微鏡(SIM)共定位
• ATAC-seq：J-Lat 10.6或TZM-bl細胞系，研究TRIM28缺失后HIV-1啟動(dòng)子的染色質(zhì)可及性
• 賴(lài)氨酸突變實(shí)驗及逆轉突變實(shí)驗以及SUMO-MS等：鑒定特異性SUMO化位點(diǎn)
• 細胞毒性相關(guān)實(shí)驗：細胞毒性測定、細胞活性測定、細胞數計數和細胞增殖測定
• 等

研究結果

1、TRIM28抑制HIV-1表達并導致HIV-1潛伏期

為了確定可能導致HIV-1抑制和潛伏的細胞靶點(diǎn)，作者定制了siRNA文庫在ZM-bl細胞系中進(jìn)行高通量篩選，該文庫靶向細胞核內的幾種細胞途徑的182個(gè)基因，包括chromatin binding, epigenetic modification, chromatin remodeling, ubiquitination, SUMOylation 和 chromosome organization。分析敲除各靶標基因后熒光素酶的表達水平變化（以siNC為對照），許多蛋白質(zhì)對應的熒光素酶表達升高，表明這些蛋白限制HIV-1啟動(dòng)子的活性，最明顯包括HP1α、GLP、SUZ12和CYLD，其已被鑒定為抑制HIV-1轉錄。其中，兩個(gè)較少見(jiàn)的SUMO化途徑基因TRIM28和SUMO4敲低后，顯著(zhù)上調了HIV-1啟動(dòng)子活性。

通過(guò)實(shí)驗發(fā)現si-TRIM28過(guò)表達抑制了HIV-1啟動(dòng)子活性的基礎水平，并以劑量依賴(lài)的方式挽救了HIV-1抑制；當與HIV-1 Tat和TNFα組合過(guò)表達時(shí)，上調更顯著(zhù)；TRIM28在多種細胞系和原代細胞中普遍表達。為搜索HIV-1潛伏相關(guān)基因，作者利用RNA-Seq比較未刺激和PHA刺激的原代CD4⁺?T細胞中的基因表達作為補充實(shí)驗，TRIM28在未刺激的原代CD4⁺?T細胞中高表達，并在PHA激活后下調。當活化的CD4⁺?T細胞恢復到靜止狀態(tài)時(shí)，TRIM28的表達再次上調。為了測試TRIM28是否有助于HIV-1潛伏，在HIV-1潛伏細胞系J-Lat 10.6以及其他HIV潛伏細胞系模型（J-Lat 6.3/8.4/9.2和15.4）中敲低了TRIM28，發(fā)現TRIM28的缺失上調了HIV-1的表達。此外，當補充廣泛定義的LRA：組蛋白去乙?；福℉DAC）抑制劑SAHA或BET結構域抑制劑JQ-1時(shí)，HIV-1重新激活增強得更高。

 

 

先前已鑒定TRIM28通過(guò)募集HDAC1以使HIV-1整合酶去乙?；瘉?lái)抑制HIV-1整合。在TZM-bl和J-Lat 10.6細胞系中進(jìn)行TRIM28的染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實(shí)驗，以研究其與整合的HIV-1 DNA的可能關(guān)聯(lián)。結果表明：TRIM28在HIV-1 LTR上顯著(zhù)富集，不受TNFα信號傳導的影響。接下來(lái)，探究了TRIM28缺失是否會(huì )影響HIV-1 LTR的表觀(guān)遺傳狀態(tài)，敲除TRIM28后H3K9me2和H3K9me3顯著(zhù)減少，以及H3K4me3和H3K9Ac顯著(zhù)增加，也誘導H3K27me3輕微下調，表明TRIM28通過(guò)控制抑制性表觀(guān)遺傳修飾來(lái)抑制HIV-1表達并導致HIV-1潛伏期。

2TRIM28 SUMO化許多轉錄因子和轉移酶

接下來(lái)，作者通過(guò)構建TRIM28不同區域的缺失突變體探究該蛋白功能。TRIM28是一種多功能蛋白，含有7個(gè)不同的結構域：由鄰近的植物同源域（PHD）SUMO化的C-末端溴結構域（BR），以SUMOylation依賴(lài)性方式募集SETDB1和NuRD復合物；N端三聯(lián)體基序RBCC區域由RING指結構域（RING）、2個(gè)B-box domians（BB）和卷曲螺旋域（CC）組成。 TRIM28的RING起分子間SUMO E3連接酶的作用，而PHD對分子內SUMO E3連接酶活性很重要。

HP1BD、NHD或BR缺失突變體，尤其是具有分子內SUMO E3連接酶活性的PHD突變體，沒(méi)有能夠顯著(zhù)地挽救抑制作用；RING或RBCC結構域缺失突變體完全中止了再抑制，這可能是由于Krüppel相關(guān)的盒結構域鋅指（KRAB-ZNFs）結合能力的喪失；而僅含有RBCC的突變體（TRIM28-RBCC）仍然恢復了抑制作用。野生型TRIM28能夠拯救抑制性表觀(guān)遺傳標記H3K9me3和H3K27me3并抑制活性表觀(guān)遺傳標記H3K9乙?；?，然而，沒(méi)有RING或PHD結構域的突變體僅能夠挽救部分抑制標記。因此，作者假設TRIM28可利用RING結構域SUMO化對HIV-1表達至關(guān)重要的細胞蛋白。

為了鑒定由TRIM28 SUMO化的候選底物，作者進(jìn)行了全局位點(diǎn)特異性SUMO化質(zhì)譜（SUMO-MS），鑒定了1,329個(gè)SUMO化蛋白，并構建了相互作用置信度為0.7的STRING互作網(wǎng)絡(luò )，MCODE分析發(fā)現STRING核心網(wǎng)絡(luò )可以聚類(lèi)成12個(gè)亞群。GO分析發(fā)現細胞和代謝過(guò)程是SUMO化蛋白可能參與的前兩個(gè)生物過(guò)程。通過(guò)k-means聚類(lèi)特異性地將轉移酶和轉錄因子聚類(lèi)，并用STRING分析進(jìn)行可視化，發(fā)現許多候選蛋白對于HIV-1表達是關(guān)鍵的，例如JUN、JUNB、JUND、mTOR、STAT3、Cyclin T1（CCNT1）和CDK9。將SUMO化蛋白鑒定的顯著(zhù)性閾值調低到10^-8，CDK9仍然排名靠前。作者在體外驗證了全局位點(diǎn)特異性SUMO-MS的可靠性。

3、CDK9由TRIM28 SUMO化

前面siRNA文庫篩選中，SUMO4缺失比其他SUMO旁系同源物缺失更顯著(zhù)上調HIV-1啟動(dòng)子活性。當與HIV-1 Tat過(guò)表達組合時(shí)，上調更顯著(zhù)，其現象與TRIM28實(shí)驗中觀(guān)察到的相似。SUMO4的敲低或敲除也能夠在J-Lat 10.6中重新激活潛在的假HIV-1。原代CD4⁺?T細胞被PHA刺激后，SUMO4的表達下調，恢復到靜止期后達SUMO4表達恢復到基礎水平。

接下來(lái)探究了SUMO4是否可以影響TRIM28的功能和HIV-1啟動(dòng)子的表觀(guān)遺傳狀態(tài)：SUMO4敲低后，超過(guò)一半的TRIM28從HIV-1 LTR中丟失，表明TRIM28在HIV-1 LTR上的富集可能是部分SUMOylation依賴(lài)性的；SUMO4敲低后H3K9me、H3K9me2和H3K9me3在HIV-1 LTR上顯著(zhù)降低，以及H3K9甲基化’writer’ SETDB1和’reader’ HP1α顯著(zhù)降低；H3K9乙?；虷3K4me3的顯著(zhù)上調和HDAC1的下調，這與先前報道TRIM28以SUMO化依賴(lài)性方式募集SETDB1、HP1α和HDAC1一致；H3K27me3在HIV-1 LTR上也降低。一些多梳抑制復合物2（PRC2）組分如EZH2和SUZ12（H3K27me3的主要’writer’）可能被SUMO4 SUMO化，導致修飾功能的增強。

作者進(jìn)一步研究SUMO4在TRIM28介導的CDK9 SUMO 經(jīng)中的作用來(lái)鑒定其潛在的機制。通過(guò)CDK9與SUMO1、SUMO2和SUMO4共同過(guò)表達實(shí)驗，發(fā)現CDK9主要由SUMO1和SUMO4 SUMO化。補充過(guò)表達TRIM28后，SUMO-CDK9量變得更豐富。然而，如果僅用TRIM28共表達CDK9但沒(méi)有SUMO E2 酶UBC9時(shí)，SUMO化水平?jīng)]有增加，這表明TRIM28介導的SUMO化是UBC9依賴(lài)性的。當TRIM28表達逐漸增加時(shí)，SUMO-CDK9 化水平以劑量依賴(lài)性增加。體外SUMO化測定表明，僅當將SUMO4、E1 SAE1/UBA2，E2 UBC9和TRIM28一起提供到SUMO化反應緩沖液中時(shí)，SUMO4與CDK9結合。在HeLa細胞中敲除TRIM28后，SUMO化的CDK9減少。前面的siRNA文庫篩選實(shí)驗中表明，幾種SUMO特異性蛋白酶(SENP)抑制HIV-1表達，尤其是SENP3，用TRIM28共表達SENP3，發(fā)現SENP3阻止了TRIM28介導的CDK9 SUMO化。作者在原代CD4⁺?T細胞中證實(shí)了以上結論?？傊?，TRIM28介導SUMO4與CDK9的結合，其被SENP3逆轉。

4、TRIM28 RING結構域在結合和SUMO化CDK9中起關(guān)鍵作用

為了確定TRIM28是否與CDK9結合，作者使用超分辨率的連續隨機光學(xué)重建顯微鏡（cSTORM）來(lái)研究分辨率為20nm二者間的三維（3D）共定位。TRIM28存在于細胞核中，與點(diǎn)狀SUMO4共定位。放大視圖和3D-cSTORM，發(fā)現SUMO4蛋白被TRIM28富集并形成大斑點(diǎn)。CDK9存在于細胞核內的分散點(diǎn)中，但仍發(fā)現CDK9與TRIM28共定位。與SUMO4類(lèi)似，CDK9蛋白被TRIM28富集并包圍TRIM28。近80％的TRIM28斑點(diǎn)或復合物與94％的SUMO4斑點(diǎn)共定位，88％的TRIM28斑點(diǎn)或復合物與76％的CDK9斑點(diǎn)共定位。

免疫共沉淀（Co-IP）實(shí)驗發(fā)現即使在RNase存在下CDK9也與TRIM28結合。為了鑒定TRIM28的哪個(gè)區域與CDK9結合，構建各種TRIM28缺失突變體以富集CDK9：RING結構域缺失中止了CDK9的結合以及CDK9的SUMO化。實(shí)驗表明外源表達的TRIM28也與CDK9共定位?？傊?，研究表明RING和PHD都具有E3連接酶活性并富集UBC9。

 

5、TRIM28 SUMO化時(shí)抑制CDK9功能

進(jìn)一步探究CDK9的功能是否受TRIM28介導的SUMO化的影響。首先，ATAC-Seq探究TRIM28缺失后HIV-1啟動(dòng)子的染色質(zhì)可及性。在J-Lat 10.6或TZM-bl細胞系中TRIM28缺失時(shí)，基因組中大多數增加的可及區域位于啟動(dòng)子和遠端基因間區域上。GO分析和COG分析表明，染色質(zhì)可及性變化發(fā)生在與各種生物過(guò)程和細胞組分相關(guān)的基因中，大多數受影響的功能基因具有DNA或蛋白質(zhì)結合能力和催化活性。

作者也對HIV-1基因組的染色質(zhì)可及性是否受到TRIM28缺失的影響進(jìn)行了分析，將ATAC-seq數據以HIV-1參考基因組進(jìn)行分析，轉座標簽密度所指示的可及區域在HIV-1 LTR上增加，這表明啟動(dòng)子活性顯著(zhù)增強。且敲除TRIM28或SUMO4后HIV-1 LTR上CDK9和Ser2超磷酸化RNAP II顯著(zhù)富集，這與TRIM28或SUMO4缺失重新激活HIV-1表達的結果一致。

Co-IP實(shí)驗發(fā)現細胞周期蛋白Cyclin T1僅與野生型CDK9結合形成正性轉錄延伸因子P-TEFb復合物，而不是SUMO化的CDK9。為了研究TRIM28介導的CDK9 SUMO化是否影響CDK9的激酶活性，進(jìn)行了體外CDK9 SUMO化測定和CDK9激酶活性測定：發(fā)現當TRIM28 SUMO化CDK9時(shí)，CDK9的激酶活性顯著(zhù)降低。不添加TRIM28，CDK9的激酶活性不受影響，盡管已添加其他SUMO化組分。

總之，TRIM28介導的SUMO化損害了CDK9與Cyclin T1的結合能力和CDK9對RNAP II的激酶活性，導致轉錄延伸功能障礙。

6、SUMO4對CDK9的Lys44\Lys56\Lys68殘基SUMO化

接下來(lái)作者試圖鑒定應該在CDK9?賴(lài)氨酸殘基上發(fā)生的SUMO化位點(diǎn)。賴(lài)氨酸突變實(shí)驗結果：CDK9-K0R突變體含有所有賴(lài)氨酸變?yōu)榫彼岬耐蛔?，完全中止了CDK9被SUMO化的能力；其他CDK9突變體仍然能夠通過(guò)TRIM28進(jìn)行SUMO化，這表明在整個(gè)CDK9序列中可能存在多個(gè)SUMOylation位點(diǎn)。采用基于CDK9-K0R全突變體的逆轉突變策略，發(fā)現CDK9上的幾個(gè)賴(lài)氨酸顯著(zhù)SUMO化。其中，多個(gè)SUMO化位點(diǎn)與CDK9 C-末端自身磷酸化位點(diǎn)相鄰，據報道這些位點(diǎn)是Tat-P-TEFb與TAR RNA高親和力結合所必需的，即?SUMO化可以通過(guò)阻止相鄰的磷酸化來(lái)降低結合能力。

為了進(jìn)一步確定哪些位點(diǎn)確實(shí)僅被TRIM28 SUMO化，作者敲除了內源性TRIM28并測試了上述鑒定候選位點(diǎn)的SUMO化潛力，發(fā)現Lys44、Lys56和Lys68的SUMO 化信號在缺乏內源性TRIM28時(shí)完全消失，進(jìn)一步支持這些位點(diǎn)被TRIM28特異性SUMO化。直接分析富集的SUMO-CDK9的靶特異性SUMO-MS也證實(shí)了該結果。Lys44的乙?；瞧浼っ富钚运匦璧?，其他2個(gè)SUMO化位點(diǎn)Lys56和Lys68在CDK9和細胞周期蛋白T1的相互作用區域內。SUMO蛋白是多肽大分子，它的存在可以形成空間位阻，從而阻止P-TEFb復合物的形成。

7、TRIM28缺失重新激活HIV-1感染者細胞中潛伏HIV-1

為了驗證TRIM28是否可以成為開(kāi)發(fā)新LRA的安全靶標，首先對Hela細胞、Jurkat細胞以及從感染者分離的靜息CD4⁺?T細胞中評估了缺失TRIM28相關(guān)的可能毒性：細胞毒性測定、細胞活性測定、細胞數計數和細胞增殖測定。結果表明TRIM28缺失對細胞活性和增殖無(wú)害。

之后作者試圖確定TRIM28的敲低是否在接受抑制性cART療法至少6個(gè)月的HIV-1感染者的靜息CD4⁺T細胞中重新激活潛伏的HIV-1?；诩毎麅菻IV-1 RNA的定量，表明用αCD3/αCD28刺激顯著(zhù)誘導HIV-1的表達。TRIM28敲低重新激活了與HDAC抑制劑SAHA相似量的HIV-1 RNA表達。在將TRIM28敲低與SAHA組合后，重新激活效果更顯著(zhù)。同樣，SUMO4敲低和SAHA添加的組合使用可以重新激活比單獨使用更多的HIV-1 RNA表達。雖然TRIM28單獨缺失重新激活相似數量的具有SAHA的遺傳多樣化HIV-1表達，但TRIM28敲低和SAHA的組合重新激活了更多遺傳多樣化的HIV-1表達。

為了確定重新激活的HIV-1是否具有復制能力，用PHA激活的健康個(gè)體分離的CD4⁺?T共培養了HIV-1感染個(gè)體的PHA刺激的、SAHA誘導的或TRIM28敲低的靜息CD4⁺?T細胞。p24抗原的累積產(chǎn)生表明重新活化的HIV-1病毒顆粒具有復制能力。TRIM28的敲低在所有3個(gè)樣品中重新激活了具有復制能力的病毒。類(lèi)似地，SAHA與TRIM28敲低的組合重新激活了更多具有復制能力的病毒顆粒。這些結果表明TRIM28有助于HIV-1感染個(gè)體的HIV-1潛伏，靶向TRIM28對HIV-1感染的CD4⁺?T細胞具有良好的適用性。

作者發(fā)現TRIM28不僅可以作為定義明確的表觀(guān)遺傳學(xué)adaptor，還可以作為SUMO E3連接酶與SUMOylate P-TEFb復合物一起發(fā)揮作用，從而顯著(zhù)抑制HIV-1的表達并導致HIV-1潛伏。提出了TRIM28介導的HIV-1潛伏模型：在活躍狀態(tài)下，P-TEFb復合物被HIV-1 Tat募集至部分轉錄的HIV-1 RNA反式激活反應元件（TAR）。 P-TEFb催化亞基CDK9使RNAP II的Ser2殘基超磷酸化，促進(jìn)RNAP II轉錄HIV-1 RNA的持續性；在潛伏狀態(tài)下，TRIM28被募集到HIV-1 LTR并在Lys44、Lys56和Lys68 SUMO化CDK9，導致CDK9激酶活性的抑制和其與細胞周期蛋白T1的隔開(kāi)，沒(méi)有Ser2的超磷酸化，RNAP II啟動(dòng)子近端暫停在LTR。因此，潛伏狀態(tài)由TRIM28介導的CDK9功能障礙和TRIM28介導的核小體nuc-1的抑制性表觀(guān)遺傳修飾維持，核小體nuc-1恰好位于HIV-1啟動(dòng)子的下游。

參考文獻：

Ma X, Yang T, Luo Y, et al. TRIM28 promotes HIV-1 latency by SUMOylating CDK9 and inhibiting P-TEFb.Elife. 2019 Jan 17;8. pii: e42426.

 

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