導讀：
單細胞測序技術(shù)自2009年問(wèn)世以來(lái)多次被Nature、Science、Nature Method等學(xué)術(shù)期刊評價(jià)為年度重點(diǎn)技術(shù)，因為單細胞技術(shù)可以彌補混合測序籠統地對腫瘤組織和微環(huán)境細胞進(jìn)行基因分析（bulk phase sequencing）等缺陷，能夠√確到單細胞水平，是生命科學(xué)領(lǐng)域研究一大利器。但在2015年以前并沒(méi)有得到廣泛應用，源于技術(shù)無(wú)法做到高通量檢測、成本較高。隨著(zhù)技術(shù)的發(fā)展和革新，Fluidigm公司的C1平臺、BD公司的Rhapsody平臺以及10x Genomics平臺等技術(shù)的出現，特別是2016年10x Genomics商業(yè)化平臺橫空出世，徹底降低了單細胞測序的成本門(mén)檻，使得單細胞測序技術(shù)能被廣泛應用于基礎科研和臨床研究，特別是對于癌癥早期的診斷、追蹤以及個(gè)體化治療具有重要意義，引領(lǐng)新一輪生物醫學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)革命。
這里小編特地檢索了目前關(guān)于單細胞RNA測序的文章發(fā)表情況，結果總計達到4300+篇，可見(jiàn)單細胞測序技術(shù)被廣泛使用，特別是2016年以后文章呈井噴式增長(cháng)，涉及的領(lǐng)域包括胚胎生長(cháng)發(fā)育、腫瘤微環(huán)境研究、干細胞分化、疾病藥物靶點(diǎn)耐藥機制、組織細胞免疫反應、神經(jīng)學(xué)科腦損傷等多方面，幾乎可以在所有的生物科學(xué)領(lǐng)域利用單細胞測序技術(shù)在單細胞水平研究生命機理。說(shuō)了那么多，我們來(lái)聊聊單細胞技術(shù)研究成果吧！
Circulation（IF=23.603）刊登了單細胞RNA測序揭示心肌成纖維細胞（CF）亞群表達特征在心肌梗死中的關(guān)鍵作用一文。該文章正是應用scRNA-seq技術(shù)檢測了帶有Col1α1-GFP標記的小鼠，結果顯示了CF的異質(zhì)性并鑒定了新的CF亞群RCF，主要負責心臟損傷后愈合反應，同時(shí)找到了心肌梗死后該細胞亞群中一個(gè)參與心室重塑過(guò)程的關(guān)鍵分子Cthrc1，表明新的細胞亞群參與心肌纖維化過(guò)程，并且Cthrc1可以調控該過(guò)程從而為心臟相關(guān)疾病提供新的治療途徑。
【英文題目】Single-Cell RNA-seq Analysis Reveals a Crucial Role for Collagen Triple Helix Repeat Containing 1 (CTHRC1) Cardiac Fibroblasts after Myocardial Infarction
【中文題目】單細胞RNA測序揭示心肌梗死后CTHRC1在心肌成纖維細胞中的關(guān)鍵作用
【發(fā)表期刊】Circulation
【影響因子】23.603
【發(fā)表時(shí)間】2020.09.25
【DOI】10.1161/CIRCULATIONAHA.119.044557
研究背景
心肌成纖維細胞(CF)在與不同類(lèi)型的纖維化相關(guān)的心室重構過(guò)程中發(fā)揮核心作用。研究表明，成纖維細胞對心臟損傷的反應并不均勻。由于真實(shí)成纖維細胞標記物是有限的，成纖維細胞群體異質(zhì)性對心臟損傷的反應仍缺乏恰當的表征。本研究的目的是確定心室重構過(guò)程中CF的異質(zhì)性以及調節其功能的潛在機制。
材料與方法
材料：7079個(gè)正常的CF；10,448 個(gè)7dpi；8,337個(gè)14dpi;6,805個(gè)30dpi；
方法：?jiǎn)渭毎D錄組測序（scRNA-seq）、ATAC-seq、RNA-seq
研究結果
1.單細胞測序表征心肌成纖維細胞異質(zhì)性圖譜
為了跟蹤心肌梗死（MI）過(guò)程中CF群體細胞的動(dòng)態(tài)變化，文章使用Col1α1-GFP標記的小鼠，通過(guò)熒光定位和流式細胞分選檢測出CF具有GFP + /CD31 – /CD45 – 表型，并且心肌梗死后GFP + 細胞在梗死區(IZ)和邊緣區(BZ)百分比和總數都增加了，顯然GFP + /CD31 – /CD45 – 的細胞表達與經(jīng)典的CF轉錄組譜一致，表明心臟的GFP +細胞是真正的成纖維細胞，驗證了Col1α1-GFP模型小鼠可用于研究心臟修復過(guò)程中的CF生物學(xué)。
為了進(jìn)一步表征心肌成纖維細胞在單細胞水平心肌梗死后的動(dòng)態(tài)變化，本文分選出GFP + CF作為單細胞轉錄組分析研究對象，利用單細胞轉錄組測序一共檢測了29,176個(gè)細胞，通過(guò)轉錄組表達分析鑒定了10個(gè)心肌成纖維細胞亞群（A-J簇），其中K簇是一個(gè)經(jīng)典的周皮細胞標記物高表達群體，B，D，I和J簇顯示特定的表達譜，代表潛在的功能CF亞群，而其余簇（A，C，E，F，G和H）顯示出較少的轉錄組特征，很可能是反映較大人群中的中間CF類(lèi)型。同時(shí)與近期CF 單細胞轉錄組測序數據相比較，GFP+ CF都在證實(shí)CF范圍內。
圖1. scRNA-seq揭示心肌成纖維細胞的異質(zhì)性
2. 新CF亞群的鑒定-RCF
為了進(jìn)一步探尋不同簇在MI過(guò)程中的潛在作用，作者通過(guò)分析不同簇細胞百分比的變化，發(fā)現F、H和K簇細胞百分比在不同時(shí)間點(diǎn)保持不變，而B(niǎo)簇在MI前后GFP+細胞百分比出現了明顯的變化，在健康的心肌中只有2.3%的GFP+細胞屬于B簇，MI后百分比急劇上升(7dpi為12%，14dpi為34%)，隨后在30dpi下降到12%。通過(guò)KEGG和GO功能預測富集分析，與其他簇相比發(fā)現B簇轉錄組基因顯著(zhù)性富集在細胞外基質(zhì)組織、細胞增殖、細胞基質(zhì)粘附相關(guān)信號通路中，明顯B簇細胞轉錄組涉及到結構性（Fmod、Comp）和膠原代謝(Ddah1、Lox、Ptn)相關(guān)的基因，而且通過(guò)鑒定發(fā)現Cthrc1可以作為B簇*顯著(zhù)性標志性分子，該基因主要參與血管重構和纖維化過(guò)程，并且B簇ECM相關(guān)基因高度特異性表達，表明B簇與纖維化過(guò)程密切相關(guān)。免疫組化分析B簇標志物分子Cthrc1, Ddah1和Fmod在7,14,30dpi的IZ和BZ區域都存在，同時(shí)利用RNAseq表達譜分析發(fā)現心肌梗死7dpi也存在B簇的表達特征。通過(guò)以上實(shí)驗，作者定義B簇為CF一個(gè)亞群，其特征有：1）在MI過(guò)程中出現；2）呈現顯著(zhù)的動(dòng)態(tài)纖維化；3）定位在受損的組織中。通過(guò)擬時(shí)序分析發(fā)現Cthrc1幾乎只在B簇細胞中表達，而其他的一些活化CF標記基因如Postn、 Acta2/αSMA在激活的早期階段表達，這也就預示著(zhù)B簇成纖維細胞是MI反應中產(chǎn)生的Postn + CF亞群的最終激活階段。
為了確定B簇細胞和其他活化的CF亞群之間的差異，作者比較了特異性表達Postn(活化的CF)、Acta2 (基質(zhì)纖維細胞)和/或Cthrc1 (B簇成纖維細胞)的CF的轉錄組譜。根據這三種標記的聯(lián)合表達，會(huì )出現不同的活化CF亞群?？偟膩?lái)說(shuō)，這些結果表明B簇細胞代表了一個(gè)特定的活化的Postn + CF亞群，在修復心臟纖維化過(guò)程中起主要作用。因此,作者將這些細胞亞群定義為修復心肌成纖維細胞(RCF)。
圖2. 新CF細胞亞群的鑒定
3. RCF形成的分子調控機制的探索
文中采用經(jīng)典的聯(lián)合組學(xué)方法研究RCF形成的分子機制。首先通過(guò)ChiP-seq數據挖掘RCF相關(guān)基因的轉錄因子，發(fā)現SOX9能與多個(gè)RCF標志分子結合，而且SOX9過(guò)表達能夠誘導CF產(chǎn)生23%的RCF，這表明了SOX9可以參與CF的激活并促進(jìn)RCF的形成。為了進(jìn)一步證實(shí)TF調控RCF的形成，作者利用ATAC-seq檢測了處于7dpi時(shí)的CD200 + /CD146 -（RCF）和CD200 – /CD146 以及不同時(shí)期 的GFP + CF，結果表明RCF具有*高的染色質(zhì)可及性。Motif分析進(jìn)一步表明RUNX1、SMAD等可作為RCF的調節因子，通過(guò)差異分析表征了調節RCF形成的三類(lèi)特征TF；同時(shí)構建蛋白信號傳導和基因調控互作網(wǎng)絡(luò )圖分析顯示RCF相關(guān)基因的表達是通過(guò)非典型的TGF-β1/PI3K-Akt信號通路驅動(dòng)的。而TGF-β1特異性抑制劑SMAD2/3和非特異性抑制劑AKT 、 p38都減少了ECM（Col1α1, Col3α1, Lox）和CF激活相關(guān)基因(Cthrc1, Ddah1, Postn, Acta2)的表達。這些結果表明，RCF的纖維化激活和表型轉化受SMAD2/3和AKT/p38的平衡調控。值得注意的是，TGF-受體1/ALK5 的特異性抑制劑SB -43154只調控Acta2和Col1α1，但不調節Postn和Col3α1。
圖3.RCF形成分子調控機制
4. CTHRC1調節RCF損傷愈合修復的活性
作者觀(guān)察到Cthrc1只在CF中而不在其他心肌細胞中表達，因此想要探討Cthrc1在CF中的功能作用。文中通過(guò)Cthrc1敲除小鼠（KO）研究發(fā)現在生長(cháng)發(fā)育成年過(guò)程中大小、體積、心臟表型都沒(méi)有太大的變化，但是心肌梗死后KO小鼠的存活率顯著(zhù)下降（80% WT vs 30% KO），這與KO梗塞心臟左心室游離壁膠原沉積的顯著(zhù)減少有關(guān)。GO富集分析發(fā)現，與WT相比較，KO CF在MI 涉及到細胞分化、增殖以及蛋白合成信號通路富集有顯著(zhù)性差異，并且通過(guò)TGF-β1誘導的KO CF在血管生成、肌肉收縮、血管系統發(fā)育等相關(guān)通路基因明顯下調，表明KO CF對TGF-β1反應調控能力降低。單細胞RNA測序進(jìn)一步分析了4189個(gè)處于7dpi的KO CF，與WT相比較，RCF類(lèi)的細胞百分比增加了（21% KO vs 14 WT）。RCF類(lèi)的CF和其他活化CF的亞群（如POSTN +）都在Cthrc1-KO梗死小鼠的IZ和BZ中被發(fā)現了，這也就說(shuō)明了心室破裂的表型來(lái)源于CTHRC1 的缺失。因此，Cthrc1的缺失與ECM組織、膠原生物合成和TGF-介導的調控有關(guān)的基因下調密切相關(guān)。這也證實(shí)了RCF通過(guò)分泌CTHRC1介導心臟修復影響ECM分子的沉積和合成，促進(jìn)CF的增殖。
圖4. CTHRC1是RCF在愈合修復過(guò)程中的重要效應因子
5. 臨床RCF表達特征圖譜驗證
為了進(jìn)一步評估RCF細胞群的表達特征圖譜，分別在臨床模型豬和人心肌成纖維組織中進(jìn)行驗證，均表明可以在MI過(guò)程中檢測到RCF，并且CTHRC1 表達的細胞只存在心肌梗死區（IZ）。最后，在缺血性心肌病患者的缺血區(IZ)和擴張型心肌病(DCM)患者的左右心室活檢中，部分發(fā)現了RCF的轉錄特征。與對照組相比，RCF轉錄組特征的幾個(gè)基因(CTHRC1、PTM、FMOD)在本研究的所有病理條件下均顯著(zhù)過(guò)表達。此外，CTHRC1 + CF在患者梗死心臟的IZ中發(fā)現，而在RZ中沒(méi)有發(fā)現。這些發(fā)現強調了CTHRC1 + RCF在指揮心臟纖維化患者心臟修復過(guò)程中的潛在作用。
圖5. RCF標志物的表達在心肌梗死模型豬和人中的驗證
總結
綜上所述，本文巧妙地利用了scRNA-seq、RNA-seq以及ATAC多組學(xué)聯(lián)合技術(shù)，表征大量的CF細胞亞群，揭示了在MI后CF的顯著(zhù)異質(zhì)性，并定義了一個(gè)具體以Cthrc1表達為特征的亞群-RCF；充分表明了Cthrc1+ CF在心肌梗死后早期愈合過(guò)程中的作用，這些新發(fā)現為患者心臟纖維化過(guò)程進(jìn)行治療提供了新方向。
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