?近年來(lái)，單細胞組學(xué)領(lǐng)域發(fā)展非常迅速，廣泛應用于人類(lèi)和動(dòng)物的研究中，為人們研究細胞異質(zhì)性以及微生物群落的生態(tài)多樣性提供了新的視角。在植物中，由于細胞壁的存在，大大阻礙了單細胞RNA測序（scRNA-seq）的應用，雖然原生質(zhì)體已用于scRNA-seq分析，但僅僅限于適合消化細胞壁的組織。許多細胞類(lèi)型在原生質(zhì)體制備過(guò)程中可能出現基因異位表達或細胞類(lèi)型偏好等問(wèn)題。隨著(zhù)scRNA-seq技術(shù)的發(fā)展，單細胞核RNA測序（snRNA-seq）讓植物單細胞測序不再受制于制備原生質(zhì)體，能夠更好的解決傳統研究中存在的細胞異質(zhì)性的問(wèn)題，為研究者們提供更多選擇。
本文介紹的是利用snRNA-seq技術(shù)，解密番茄莖尖的發(fā)育軌跡，在這里，本文展示了一種用于高通量單核RNA測序（snRNA-Seq）的方法，該方法可用于分析番茄莖尖細胞。
獲得的高分辨率表達圖鑒定了主要的莖尖組織和發(fā)育階段的不同細胞類(lèi)型，描繪了葉肉細胞，脈管系統細胞，表皮細胞和毛狀體細胞的發(fā)育軌跡。這項研究證明了snRNA-seq在植物研究中的作用，并為異質(zhì)莖尖細胞提供了時(shí)空基因表達圖譜。該文章已發(fā)表在預印本雜志BioRxiov上。
文章題目：Single-nucleus RNA-seq resolves spatiotemporal developmental trajectories in the tomato shoot apex
細胞核提取方法
材料預處理：在解剖顯微鏡下對番茄莖尖進(jìn)行解剖，保留了2周齡植株的莖尖分生組織區和早期葉原基，葉原基到P3(第三片葉的葉原基）。
細胞核提取方法：將冷凍番茄莖尖分生組織重懸于10ml含0.1%蛋白酶抑制劑的核分離液（NIB：10 mM MES-KOH（pH = 5.4），10 mM NaCl，10 mM KCl，2.5 mM EDTA，250 mM蔗糖，0.1 mM精胺，0.5 mM亞精胺，1 mM DTT）中，在冰上使用勻漿器低速勻漿，冰上裂解30分鐘后，將勻漿物在三層尼龍網(wǎng)中過(guò)濾兩次。同時(shí)為了消除葉綠體，將10％Triton X-100滴加到溶液中，使其最終濃度為0.1％（v / v），直到大多數葉綠體降解為止。然后將核懸浮液以1000 g離心5分鐘。將沉淀的核洗滌兩次，然后將其懸浮在NIB中。通過(guò)臺盼藍染色確定細胞核的質(zhì)量和濃度，并在顯微鏡下計數。
結果
1.原生質(zhì)體引起異位基因表達
莖尖分生組織和早期葉片原基具有復雜的細胞結構，該結構由嵌入不同組成的細胞壁中的異質(zhì)細胞組成。制備原生質(zhì)體，需要長(cháng)時(shí)間的酶消化。異位激活和隨機基因的表達與原生質(zhì)體形成相關(guān)。為了評估原生質(zhì)體對基因表達的影響，本文檢測擬南芥葉片和葉肉原生質(zhì)體中的基因表達，并觀(guān)察到頻繁的異位激活。例如，WOX2未在葉子中表達（圖1a）。追蹤了10,000多個(gè)原生質(zhì)體，觀(guān)察到超過(guò)21％的原生質(zhì)體表達了WOX2（圖1b）。該觀(guān)察結果強烈暗示通過(guò)原生質(zhì)體化存在基因表達的異位隨機激活。
圖1葉片和原生質(zhì)體中WOX2的表達模式
2.snRNA-seq鑒定了番茄莖尖的主要細胞類(lèi)型
根據本文細胞核提取的方法，得到正常形態(tài)的番茄莖尖分生組織的細胞核，進(jìn)行snRNA-seq。（圖2a）。經(jīng)過(guò)質(zhì)量控制和過(guò)濾，獲得了13377個(gè)核，檢測到基因數為21402。為了評估snRNA-seq數據的可重復性和敏感性，本文用番茄莖尖進(jìn)行Bulk RNA-seq。snRNA-seq檢測到的基因，有92.3%可以通過(guò)Bulk RNA-seq檢測到（FPKM > 1），表明snRNA-seq具有較高的敏感性，snRNA-seq和Bulk RNA-seq的相關(guān)性達到0.9（圖2b），表明具有很高的重現性。
圖2 snRNA-seq繪制番茄莖尖細胞圖譜
為了鑒定不同的細胞類(lèi)型，本文采用無(wú)監督聚類(lèi)分析。采用t-SNE算法，將細胞核分組為16個(gè)clusters(圖2c)。每個(gè)cluster具有顯著(zhù)差異的基因表達模式。鑒定了每個(gè)cluster的一系列特異性標記基因(圖3a)。為了注釋這些clusters，本文將cluster的marker基因與已知的marker基因進(jìn)行了關(guān)聯(lián)。此外，本文還與擬南芥富集于相應細胞結構域的同源基因相關(guān)聯(lián)。本文發(fā)現在幾個(gè)clusters中，顯著(zhù)富集到擬南芥細胞域特異性的同源基因，這些結構域包括表皮，葉肉和脈管系統域（圖4）。此外，在擬南芥分生組織中廣泛表達的marker基因SlSTM和SlBP在clusters 0、3、4、5、6、7中特異性表達，由此得出，本文的樣本中有相當一部分與莖尖分生組織相對應?；谝陨闲畔?，將clusters分為4個(gè)cluster clouds，分別對應于番茄的表皮和毛狀體（clusters 2、7、9、10和16），葉肉（clusters 1、12和14），脈管系統（clusters 4、11和15）和分生組織細胞（clusters 0、3、5、6、8和13）（圖2c，d）。
總之，本文鑒定了莖尖的主要的細胞類(lèi)型，提供了莖尖細胞空間分布的基因表達信息（圖3b,d）.
圖3 marker 基因的表達模式和細胞空間分布
圖4 細胞類(lèi)型特異性基因的富集分析
3.番茄莖尖細胞軌跡分析
單細胞轉錄組學(xué)可以捕獲具有過(guò)渡狀態(tài)的細胞，從而使本文能夠追蹤特定細胞類(lèi)型的發(fā)育軌跡。為了獲得莖尖細胞發(fā)育軌跡圖，本文用uMAP算法分析clusters聚類(lèi)和等級結構（圖3c），鑒定出相似的clusters，對應分生組織細胞的clusters位于中心。起源于分生組織細胞的莖尖細胞連續分化形成表皮細胞，毛狀體細胞，葉肉細胞和脈管系統細胞。
根據細胞軌跡分析，在莖尖分生組織的外圍區域處葉片開(kāi)始萌發(fā)，葉肉細胞分化，伴有脈管系統的形成。細胞發(fā)育軌跡起始于分生組織細胞（cluster 3），葉肉細胞（clusters 1和12）與脈管系統細胞（clusters 4,11和15）明顯分離，隨后，脈管系統細胞分離為木質(zhì)部細胞和韌皮部細胞（圖5a，b）
圖5 葉肉細胞和脈管系統的發(fā)育軌跡
結論
細胞壁的存在極大阻礙了單細胞轉錄組學(xué)在植物研究中的應用。在這項研究中，本文開(kāi)發(fā)了一種處理組織的方法，可對幾乎任何植物細胞類(lèi)型進(jìn)行snRNA-seq分析。此外，snRNA-seq有望減輕與原生質(zhì)體形成相關(guān)的異位基因表達變化。本文用snRNA-seq已獲得番茄莖的高分辨率細胞表達圖譜，可識別大多數已知的細胞類(lèi)型，并在細胞和分子水平上表現出顯著(zhù)的異質(zhì)性。綜上所述，本文提供了一個(gè)強大的單核轉錄組分析流程，可以廣泛應用于其他物種和組織，并為研究干細胞穩態(tài)和早期器官發(fā)生提供了寶貴的資源。
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