英文題目：CircRNA Expression Pattern and ceRNA and miRNA–mRNA Networks Involved in Anther Development in the CMS Line of Brassica campestris
發(fā)表期刊：International Journal of Molecular Sciences
影響因子：5.923
研究背景
在以往的研究中，CircRNA作為內源非編碼RNA的一員，被認為具有miRNA海綿和競爭性?xún)仍碦NA（ceRNA）功能。關(guān)于CircRNA在雄性不育和花藥發(fā)育中研究較少，因此作者在油菜中構建了細胞質(zhì)雄性不育系（CMS），對不育系和可育系花蕾進(jìn)行全轉錄組測序，揭示了油菜花藥發(fā)育中新的circRNA–miRNA–mRNA調控網(wǎng)絡(luò )，為進(jìn)一步研究CircRNA和miRNA在花藥發(fā)育中的功能提供了一定的基礎。
研究方法
材料：選取不育系Bcpol97-05A和保持系Bajh97-01B，開(kāi)花后采樣，3個(gè)生物學(xué)重復
方法：構建lncRNA、sRNA兩個(gè)文庫，完成測序
平臺：北京百邁客生物科技有限公司illumina測序平臺進(jìn)行測序，使用百邁客云平臺進(jìn)行相關(guān)的生物信息學(xué)分析
結果分析
1. circRNA鑒定
使用了find_circ進(jìn)行了circRNA鑒定，在不育系和可育系中總共鑒定到了1443個(gè)circRNA，其中可育系鑒定到了879個(gè)，不育系鑒定到了685，有121個(gè)是共同的。大多數circrNA位于10條染色體上（見(jiàn)下圖）?；赾ircRNA的基因組分布進(jìn)行了分類(lèi)，其中外顯子circRNA有911個(gè)，內含子circRNAyou 182個(gè)，間區有350個(gè)。對circRNA長(cháng)度分布統計發(fā)現，長(cháng)度在200bp到400bp的最多。
2. 不育系相對于可育系的差異分析
差異分析時(shí)，閾值使用了差異倍數（FC）≥2和FDR≤0.05，其中差異circRNA、差異miRNA和差異基因分別為31、47和4779個(gè)，對差異基因進(jìn)行KEGG分析發(fā)現主要富集在“淀粉和蔗糖代謝”、“苯丙烷生物合成”、“戊糖和葡萄糖醛酸相互轉化”和“植物激素信號轉導”等途徑。通過(guò)GO分析發(fā)現差異基因主要是涉及花粉管發(fā)育相關(guān)的功能。
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? KEGG分類(lèi)注釋結果
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? GO分類(lèi)注釋結果
為進(jìn)一步驗證RNA-seq的結果，作者隨機挑選了5個(gè)circRNA、8個(gè)miRNA和8個(gè)基因進(jìn)行了qRT-PCR驗證，發(fā)現與RNA-seq結果一致。
3.?差異miRNA-和差異基因的調控網(wǎng)絡(luò )構建
作者使用了TargetFinder來(lái)預測miRNA的靶基因，結合差異分析的結果最終得到170對miRNA和基因的調控關(guān)系，包含了18個(gè)miRNA和37個(gè)基因。對這些基因進(jìn)行GO富集分析，發(fā)現主要是細胞過(guò)程、代謝過(guò)程等功能。對構建的網(wǎng)絡(luò )進(jìn)行研究發(fā)現miRNA所調控的基因主要是涉及糖代謝、脂質(zhì)代謝、花粉管生長(cháng)等，同時(shí)也發(fā)現這些miRNA與植物激素相關(guān)，比如bra-miR9556-5p可能通過(guò)靶向Bra008715來(lái)參與水楊酸介導的信號通路和油菜素類(lèi)固醇生物合成過(guò)程途徑。
4.?構建差異circRNA、差異基因、差異miRNA等3者的調控網(wǎng)絡(luò )
為了進(jìn)一步挖掘和花藥發(fā)育相關(guān)的ceRNA調控關(guān)系以及相關(guān)的circRNA，作者利用miRNA靶向基因、circRNA的關(guān)系分析了ceRNA，再結合差異分析的結果構建了調控網(wǎng)絡(luò )。調控網(wǎng)絡(luò )包含1個(gè)circRNA、2個(gè)miRNA和5個(gè)基因（見(jiàn)下圖），其中2個(gè)miRNA表達水平也與其靶基因和靶circRNA呈現負相關(guān)。
小結
研究人員對油菜細胞質(zhì)雄性不育系進(jìn)行了全轉錄組測序，鑒定出一些與花藥發(fā)育相關(guān)的基因、circRNA和miRNA，利用Cytoscape構建mirna介導的調控網(wǎng)絡(luò )和ceRNA網(wǎng)絡(luò ),重構了這些RNAs之間的調控關(guān)系，并對于關(guān)鍵的子網(wǎng)絡(luò )相關(guān)基因進(jìn)行了功能注釋分析，挖掘出調控的關(guān)鍵功能通路，加深了對花藥發(fā)育及雄性不育的理解。
全轉錄組產(chǎn)品介紹
全轉錄組測序所研究的對象，即是特定細胞在某一時(shí)間所轉錄出的編碼（mRNA）和非編碼RNA(包含lncRNA,?circRNA,?miRNA)。在生物體內，任何一類(lèi)RNA分子都不是孤立的，他們行使不同的生物學(xué)功能，參與調控機體的重要通路，隨著(zhù)測序成本的不斷降低及通量的不斷提高，也使得同時(shí)分析一份樣品的mRNA,?lncRNA,?circRNA和miRNA在技術(shù)上和經(jīng)濟上成為可能?？梢匀娴慕沂旧矬w復雜的調控機制，進(jìn)而廣泛的應用于動(dòng)植物的生長(cháng)發(fā)育和凋亡、免疫調控、疾病發(fā)生發(fā)展以及藥物靶標研究等。
全轉錄組測序技術(shù)不僅可同時(shí)檢測mRNA、lncRNA、circRNA、?microRNA，而且可結合多種RNA信息進(jìn)行ceRNA整合分析，探究其潛?在的調控網(wǎng)絡(luò )機制，已成為解釋生物學(xué)現象的研究利器。并且可以進(jìn)行兩兩間關(guān)聯(lián)分析和兩者以上ceRNA網(wǎng)絡(luò )調控分析，有助于縮小篩?選范圍，挖掘關(guān)鍵基因。一方面節省了樣本量，另一方面使用同一批次樣本提高了研究結果可比性，兩個(gè)文庫即可完成整個(gè)項目，項目性?xún)r(jià)比極高。
百邁客生物有多年的全轉錄組分析經(jīng)驗，項目覆蓋領(lǐng)域全，分別為林木、哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)、作物和水產(chǎn)等，建庫經(jīng)驗十分豐富，起始量低樣本也可進(jìn)行常規建庫。同時(shí)百邁客云平臺加持，急速分析，輕松實(shí)現自由個(gè)性化分析，深度挖掘轉錄水平調控網(wǎng)絡(luò )。
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