隨著(zhù)測序行業(yè)的飛速發(fā)展，探究影響表型變化的因素的產(chǎn)品層出不窮，不管是從DNA水平還是RNA水平，還是現在火熱的代謝物水平，都有各自的組學(xué)研究系統，這些組學(xué)之間的關(guān)系就像一條從上到下的河流，DNA水平的基因組學(xué)處于最上游，決定了河流的開(kāi)始和基本屬性，好比不同的物種都有特定的基因序列特征，并且是相對保守的。但是河流的上游無(wú)法決定河流下游的去向，就像基因不能完全決定最后的表型。因為基因后面還有表觀(guān)遺傳修飾，還有轉錄，翻譯，環(huán)境的影響，并且這些改變和影響最終都會(huì )體現在代謝物的差異上。所以我們可以看出，單一組學(xué)的數據難以系統全面地解析復雜生理過(guò)程的調控機制，多組學(xué)聯(lián)合分析可以共同探究生物體內潛在的調控網(wǎng)絡(luò )機制，為生物體作用機制提供了更多證據。當然，除了基因發(fā)生突變，會(huì )直接影響代謝物水平和表型，環(huán)境的影響也會(huì )體現在表型和代謝物水平上，比如根際微生物和植物的互作作用，腸道微生物對于宿主的影響等等。
中心法則是遺傳的基礎，在中心法則中，RNA處于重要的中央樞紐地位，轉錄組作為生信科研中的“萬(wàn)金油”，最大的特點(diǎn)就是“短平快”，是功能基因的研究利器，是利用率最高，最成熟的測序手段，在多組學(xué)聯(lián)合中扮演中重要的角色。代謝組是表型的直接體現者，“代謝組+ ”研究模式已經(jīng)在多個(gè)領(lǐng)域廣泛使用，成為深入研究科學(xué)問(wèn)題，系統闡釋作用機制的利器。以下就是常見(jiàn)的基于這兩個(gè)組學(xué)的聯(lián)合分析策略。
今天主要先從轉錄組+代謝組方向進(jìn)行聯(lián)合分析內容的說(shuō)明。
mRNA+代謝組
轉錄組測序可以得到大量差異基因、眾多調控網(wǎng)絡(luò )。難以確定關(guān)鍵途徑，也無(wú)法鑒定控制關(guān)鍵途徑的結構，而代謝物是生命活動(dòng)最終的體現者，表型性狀的微小變化在代謝水平會(huì )呈指數放大，可以利用代謝組來(lái)反映表型的狀態(tài)變化，但是單獨代謝組檢測，無(wú)法解釋影響表型的基因機理。轉錄本水平的基因變化是否真的是決定表型變化的關(guān)鍵基因？這個(gè)問(wèn)題需要通過(guò)轉錄組和代謝組的聯(lián)合分析進(jìn)行回答。
轉錄組+代謝組的多組學(xué)分析，可以同時(shí)實(shí)現從“因”和“果”兩個(gè)層面來(lái)探究生物學(xué)問(wèn)題，相互間進(jìn)行驗證，從海量的數據中篩選出關(guān)鍵基因、代謝物及代謝通路，深度解析生物系統的宏觀(guān)發(fā)育過(guò)程，解釋生物過(guò)程的復雜性和整體性，提高文章的水平。
樣本準備
轉錄組和代謝組的聯(lián)合分析通常為一份材料同時(shí)送測兩個(gè)組學(xué)，這樣對于樣本量準備會(huì )有更高的要求，普通轉錄組推薦準備有三個(gè)生物學(xué)重復，而代謝組的要求更高，需推薦單樣本有六個(gè)生物學(xué)重復，生物學(xué)重復不僅能夠消除組內誤差、作為實(shí)驗設計質(zhì)控點(diǎn)用于判斷實(shí)驗設計過(guò)程是否異常、檢測離群樣本有效規避實(shí)驗失敗的風(fēng)險，更重要的是可以增強結果的可靠性，嚴謹的實(shí)驗更容易發(fā)表高分文章。（特別對于臨床研究的項目，由于研究的對象有復雜的遺傳背景，生活方式，個(gè)體年齡性別體質(zhì)等等，導致難以實(shí)現背景一致性的樣本，所以更要通過(guò)生物學(xué)重復的設置來(lái)降低樣本間的背景差異造成的影響。)
分析思路
轉錄組通過(guò)標準分析流程得到差異表達基因功能富集等分析結果，代謝組根據不同的產(chǎn)品類(lèi)型，可以鑒定得到樣本中表達的代謝物，并分析得到差異代謝物及代謝通路富集結果。將差異基因和差異代謝物在KEGG上共富集的基因和代謝物進(jìn)行聯(lián)合分析，并計算差異基因和差異代謝物的相關(guān)性，構建相關(guān)性網(wǎng)絡(luò )，可以找出引起代謝物發(fā)生變化的關(guān)鍵作用基因，確定關(guān)鍵的調控通路。
分析內容
代謝與轉錄組聯(lián)合分析是基于兩個(gè)組學(xué)各自的標準分析結果，將差異代謝物和差異基因在代謝通路上的注釋結果進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，可以在代謝通路上更好地解釋轉錄調控機制。常規的聯(lián)合分析內容主要包括代謝組和轉錄組KEGG通路分析、KEGG共富集分析、相關(guān)性分析、差異基因和差異代謝物趨勢分析、典型相關(guān)性分析、限制性對應分析等內容。
一、代謝組和轉錄組KEGG通路分析
差異代謝物分析結果結合轉錄組差異基因分析結果，將相同分組的差異基因及差異代謝物同時(shí)映射到KEGG通路圖上，用綠色和紅色標注基因或代謝物表達量顯著(zhù)下調或上調的節點(diǎn)，藍色標注既有上調又有下調的基因，更好的了解基因與代謝物之間的關(guān)系。
二、KEGG共富集分析
進(jìn)行KEGG注釋時(shí)，差異代謝物與差異基因同時(shí)注釋的通路往往有很多。這種情況下，挑選基因和代謝的通路富集系數pvalue<0.05優(yōu)先進(jìn)行分析，這樣可以節約篩選數據的時(shí)間，快速找到與研究目的相關(guān)的通路進(jìn)行后續分析。
三、基因與代謝物相關(guān)性分析
將不同差異分組基于皮爾遜相關(guān)性(pearson)方法計算所有基因和代謝物之間的相關(guān)性，然后按照相關(guān)性系數（Correlation Coefficient,CC）和相關(guān)性的pvalue篩選表達相關(guān)性較高的基因和代謝物。并利用九象限圖對于篩選后的基因和代謝物的表達趨勢進(jìn)行分析，例如基因和代謝物表達趨勢一致或相反，表明基因可能是正向或者負向調控代謝物，或者基因/代謝物表達發(fā)生變化，但是對應的代謝物/基因表達不變，則說(shuō)明還有其他的調控機制參與到整個(gè)代謝通路中。
四、差異基因和差異代謝物趨勢分析
將各個(gè)分組對差異代謝物和差異基因分別用Kmeans進(jìn)行分類(lèi)，然后按分類(lèi)進(jìn)行繪圖，可找到變化趨勢一致代謝物和基因，這些趨勢一致代謝物和基因之間可能存在一定的關(guān)系，為研究提供了一定的方向。
五、相關(guān)性網(wǎng)絡(luò )圖
按通路選取經(jīng)過(guò)相關(guān)性篩選的差異基因和差異代謝物繪制網(wǎng)絡(luò )圖，通過(guò)網(wǎng)絡(luò )圖來(lái)可直觀(guān)的表示代謝物和基因之間的關(guān)系。
六、典型相關(guān)分析
典型相關(guān)分析（canonical correlation analysis, CCA），是利用綜合變量對之間的相關(guān)關(guān)系來(lái)反映兩組指標之間的整體相關(guān)性的多元統計分析方法。對相關(guān)性網(wǎng)絡(luò )圖中的差異基因及差異代謝物進(jìn)行典型相關(guān)分析，圖中以十字區分出四個(gè)區域，在同一個(gè)區域內，距原點(diǎn)越遠關(guān)聯(lián)性越高，在同一個(gè)象限內距離較近的代謝物和基因之間相關(guān)聯(lián)的程度高，基于此結果可進(jìn)一步挖掘和代謝物最相關(guān)的基因。
七、 限制性對應分析
對應分析(Correspondence Analysis)也稱(chēng)關(guān)聯(lián)分析，是一種多元統計分析技術(shù)，通過(guò)分析由定性變量構成的交互匯總表來(lái)揭示變量間的聯(lián)系?？梢越沂就蛔兞康母鱾€(gè)類(lèi)別之間的差異，以及不同變量各個(gè)類(lèi)別之間的對應關(guān)系。對通路中的差異代謝物和差異基因進(jìn)行限制性對應分析可直觀(guān)展示他們之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系。
以上就是轉錄組和代謝組聯(lián)合分析的主要內容，由于生物過(guò)程具有復雜性和整體性，多種物質(zhì)共同影響生命系統的表型和性狀，例如環(huán)境、基因、mRNA、調控因子、蛋白、代謝等，這些組學(xué)之間，既相互獨立，又互相影響，既有很大的差別，又有相似之處。多種多樣的組學(xué)聯(lián)合分析將不同層面之間信息進(jìn)行整合，從不同的組學(xué)角度共同探究生物體內潛在的調控網(wǎng)絡(luò )機制，深層次理解各個(gè)分子之間的調控及因果關(guān)系，從而更深入的認識生物進(jìn)程和疾病過(guò)程中復雜性狀的分子機理和遺傳基礎，后續我們還將推出其他常見(jiàn)的組學(xué)聯(lián)合分析內容的介紹，敬請期待。
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