中文名: 通過(guò)根瘤菌和叢枝菌根真菌在鎘污染土壤中的共接種提高苜蓿對鎘脅迫的抗性
英文名: Improvement of alfalfa resistance against Cd stress through rhizobia and arbuscular mycorrhiza fungi co-inoculation in Cd-contaminated soil
雜志：Environmental Pollution，2021
影響因子：8.071
研究背景
根瘤菌和叢枝菌根真菌（AMF）是重要的共生微生物，對生長(cháng)在金屬污染土壤中的植物有利。然而，目前仍不清楚接種的微生物如何影響根際微生物群落，或者根際微生物群落的后續變化是否有助于提高金屬脅迫下的植物抗性。
研究目的
研究接種根瘤菌和AMF對苜?？规k（Cd）脅迫的影響，利用16S和ITS rRNA基因的高通量測序，進(jìn)一步分析了根際微生物群落接種后的響應及其在提高紫花苜?？剐苑矫娴淖饔?。
技術(shù)路線(xiàn)
研究結果
1、根際土壤理化性質(zhì)
根據雙因素方差分析的結果，Cd、接種處理及其相互作用對NO3–N， NH4 +-N ，SOC和AP含量有顯著(zhù)影響（P<0.05）。對于所有Cd處理，除土壤pH值外，SOC含量，SOC:TN和SOC:TP比值均高于對照。此外，共同接種顯著(zhù)增加了NH4+-N和AP含量。
2、植物的物理化學(xué)性質(zhì)和植物組織對Cd的吸收情況
添加Cd和接種根瘤菌以及AMF都顯著(zhù)影響紫花苜蓿生物量，包括芽和根(P＜0.01；表1)。此外，接種處理大大提高了紫花苜蓿的芽和根生物量，而添加Cd則顯著(zhù)降低了紫花苜蓿的芽和根生物量（P＜0.01）。例如，在添加Cd的根瘤菌和AMF共同接種的處理中，紫花苜蓿生物量最高（3.35±0.116 g /pot）。此外，紫花苜蓿芽和根中的Cd濃度顯著(zhù)受Cd添加、接種及其相互作用的影響。接種和Cd處理大大增加了紫花苜蓿芽和根的Cd吸收含量（表1）。與對照(未接種)相比，所有接種處理下根中的Cd含量均高于芽中的Cd含量(P <0.05)。此外，相對于對照而言，在添加Cd后，接種處理芽中的Cd濃度均高出1.2倍。在添加Cd的共同接種處理中，芽中Cd的總吸收量最高(30.6±1.81mg/pot)。與添加Cd的對照(未接種)相比，單獨接種和共同接種處理的芽中，Cd的總吸收量顯著(zhù)更高（系數分別為1.4和1.6），（P <0.05）。在單獨接種和未接種處理中，根瘤菌和AMF共同接種處理的總Cd吸收量最高。
接種后，芽和根的抗氧化能力明顯增強，其中AR、AM和ARM處理的SOD、CAT和POD活性均顯著(zhù)高于A(yíng)處理（P＜0.05；表2）。與未接種和單獨接種處理相比，根瘤菌和AMF共同接種處理中紫花苜蓿的SOD、CAT和POD活性最高。例如，在A(yíng)RM處理中，芽的SOD活性比A處理大1.4倍。AR、AM和ARM處理中芽的MDA含量明顯低于A(yíng)處理(分別降低27.28%、21.81%和34.09%)(P＜0.05；表2)。此外，與對照未接種植物相比，共同接種處理中MDA、H2O2和O2-含量最低。
表1 生物量、Cd含量和植物組織對Cd的吸收。
表2 不同處理中植物芽的丙二醛(MDA)、活性氧(O2-，H2O2)和抗氧化酶(超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和過(guò)氧化物酶(POD))含量。
3、根際微生物群落的α多樣性
所有土壤樣品共鑒定出4847280條高質(zhì)量的微生物序列，其中真菌序列2593280條，細菌序列2254000條，在97%的相似度截止水平下，可分別聚類(lèi)為904和197個(gè)OTU。對于細菌群落來(lái)說(shuō)，OTU、ACE、Chao1、Simpson和Shannon-Wiener指數均受到Cd添加、接種及其相互作用的顯著(zhù)影響(P＜0.05；圖1)。特別是在接種處理下，Cd的添加大大降低了細菌Simpson多樣性指數。在添加Cd的情況下，接種顯著(zhù)降低了細菌Simpson多樣性指數，而在對照處理中則增加了細菌Simpson多樣性指數。對于真菌群落來(lái)說(shuō)，Cd的添加、接種以及它們之間的相互作用對Chao1和Simpson多樣性指數都有明顯的影響。特別是在所有接種處理下，Cd的添加都顯著(zhù)提高了真菌的Simpson多樣性指數（P＜0.05；圖1）。接種與添加Cd處理和對照處理都能顯著(zhù)提高真菌的Simpson多樣性指數。添加Cd處理和對照處理，接種后均可顯著(zhù)提高真菌的Simpson多樣性指數。
圖1 不同處理之間細菌（A，B），真菌（C，D）α多樣性的差異。
4、根際微生物群落的結構
我們的研究在所有不同的處理中檢測到了10個(gè)細菌門(mén)類(lèi)(相對豐度>1%)，即變形菌門(mén)（Proteobacteria）、放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、藍藻細菌門(mén)（Cyanobacteria）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、髕骨細菌門(mén)（Patescibacteria）、芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）和疣微菌門(mén)（Verrucomicrobia） (圖2A)。相對豐度<1%的其他種群被歸為”Others”。在所有處理中，Bacteroidetes、Actinobacteria、Proteobacteria和Firmicutes是主要的細菌門(mén)。Cd添加、接種及其相互作用顯著(zhù)影響了Firmicutes、Bacteroidetes和Acidobacteria的相對豐度。特別是Cd的添加，明顯降低了所有接種(AR、AM和ARM)處理中Actinobacteria的相對豐度，而增加了兩個(gè)接種(AM和ARM)處理中Firmicutes的相對豐度。
我們的研究在所有不同的處理中檢測到了10個(gè)真菌門(mén)類(lèi)(相對豐度>1%)，即子囊菌門(mén)（Ascomycota）、Unclassified、擔子菌門(mén)（Basidiomycota）、球囊菌門(mén)（Glomeromycota）、被孢霉門(mén)（Mortierellomycota）、壺菌門(mén)（Chytridiomycota）、毛霉門(mén)（Mucoromycota）、尾蟲(chóng)門(mén)（Cercozoa）、油壺菌門(mén)（Olpidiomycota）和羅茲菌門(mén)（Rozellomycota） (圖2B)。在所有處理中，占主導地位的真菌門(mén)為Ascomycota（44.3-65.7%）和Unclassified（14.9-36.6%）。Cd的添加顯著(zhù)影響了Cercozoa和Rozellomycota的相對豐度，接種后極大地影響了Glomeromycota、Mortierellomycota和Rozellomycota的相對豐度(P <0.05)。其他菌類(lèi)在真菌群落組成中只占很小的一部分，如Basidiomycota和Glomeromycota。同時(shí)，對指示菌種的分析表明，從門(mén)到科水平的這些細菌類(lèi)群(Proteobacteria、Actinobacteria、Acidobacteria、Chloroflexi、Bacteroidetes和Firmicutes)和真菌類(lèi)群(Glomeromycota、Mortierellomycota和Rozellomycota)都是根瘤菌和AMF共同接種后根際微生物群落的主要指標(表3)。
雙因素方差分析表明，添加Cd、接種及其相互作用極顯著(zhù)地影響了細菌和真菌的群落結構(P＜0.001)。此外，NMDS和ANOSIM分析表明，真菌和細菌群落結構在Cd和接種處理中均有顯著(zhù)差異(P＜0.001；圖3)。部分Mantel檢驗進(jìn)一步證實(shí)，添加Cd和接種處理與真菌和細菌群落內的異質(zhì)性都有很大的相關(guān)性。
圖2 不同處理中主要細菌（A）和真菌（B）類(lèi)群的相對豐度。
表3 通過(guò)添加Cd處理后的指示性類(lèi)群分析，在門(mén)類(lèi)水平將分類(lèi)群確定為根際潛在指標。
圖3 從Bray-Curtis距離矩陣得出的非度量多維標度（NMDS）排序圖。
5、微生物群落與土壤特性的關(guān)系
Pearson相關(guān)分析發(fā)現，Cd、OTU和細菌群落的α多樣性指數(即Shannon、Simpson、Chao1和ACE)之間存在顯著(zhù)的相關(guān)性(P＜0.05)。除Shannon指數外，SOC、TN、SOC:TN和SOC:TP與OUT以及細菌群落中的這些α多樣性指數之間存在顯著(zhù)的相關(guān)性。但是，除了真菌群落的OTU和Shannon與SOC和SOC:TN外，真菌群落的α多樣性指數與這些土壤性質(zhì)之間沒(méi)有發(fā)現明顯的相關(guān)性。
VPA的結果表明，土壤性質(zhì)和Cd含量一般能解釋細菌群落的大部分變化（62.8%），而它們只能解釋真菌群落12.9%的變化（圖4A和B）。Mantel檢驗和相關(guān)分析表明，除TP和SOC:TP外，其他土壤變量均與細菌群落顯著(zhù)相關(guān)，而只有Olsen-P和pH值對真菌群落有顯著(zhù)影響（圖4C）。此外，RDA還證實(shí)，與不同處理的真菌群落相比，土壤變量對不同處理的細菌群落有更明顯的影響。根據相關(guān)性熱圖和RDA或CCA，細菌群落中的Actinobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes、Acidobacteria和Chloroflexi與除TP外的其他土壤變量顯著(zhù)相關(guān)(P＜0.05；圖4D)。然而，在真菌群落中，只有Chytridiomycota、Olpidiomycota和Rozellomycota與大多數土壤變量表現出明顯的相關(guān)性(P <0.05；圖4E)。
圖4 變異分區分析顯示了細菌（A）和真菌（B）群落解釋的土壤特性和土壤Cd的差異百分比。土壤變量與微生物群落結構之間的關(guān)系（C）。細菌類(lèi)群（門(mén)水平，D）和真菌類(lèi)群（門(mén)水平，E）與土壤特性的相關(guān)熱圖。
6、接種和添加Cd處理與微生物群落、土壤特性、植物生物量和Cd吸收的級聯(lián)關(guān)系
PLS-PM表明，接種根瘤菌和ARM直接影響真菌和細菌多樣性，間接影響抗氧化酶活性、脂質(zhì)過(guò)氧化和苜蓿生物量。接種對細菌多樣性（OTU、ACE、Chao-1、Simpson和Shannon指標）有正向影響，但對真菌多樣性無(wú)顯著(zhù)影響。接種正向影響抗氧化酶活性和苜蓿生物量，負向影響脂質(zhì)過(guò)氧化（圖5D）。接種對抗氧化酶活性（0.60）和植物生物量（0.55）的影響最大。
圖5 處理（接種和添加Cd）與微生物群落、土壤特性和植物抗性的級聯(lián)關(guān)系。偏最小二乘路徑模型(PLS-PM)剖析了處理、微生物群落和土壤特性對植物抗性的主要影響途徑(A)(B)；以及每個(gè)變量對植物生物量、抗氧化酶和脂質(zhì)過(guò)氧化物的總影響(C)(D)。
討論
1、 根瘤菌與AMF共接種對Cd脅迫下植物抗性的影響
本研究發(fā)現，苜蓿生長(cháng)4個(gè)月后生物量明顯增加，根瘤菌和AMF處理的生物量最高（表1）。與未接種的處理相比，使用根瘤菌或AMF的單次接種處理伴隨著(zhù)生物量的增加和營(yíng)養物質(zhì)的獲得。有的研究表明，接種AMF增加了豆科植物的根瘤數量，這表明菌根的形成提供了足夠的磷（P）來(lái)支持根瘤和類(lèi)桿菌的生長(cháng)。在所有接種處理中，根瘤菌和AMF共接種處理對緩解苜蓿Cd脅迫的總體效果最大。
補救策略的可行性在很大程度上取決于土壤中殘留重金屬的生物活性及其在植物中的利用率。根瘤菌和AMF共同接種處理中，紫花苜蓿芽和根的Cd吸收總量明顯高于單獨接種或未接種處理（表1）。苜蓿芽中的Cd濃度保持穩定，說(shuō)明接種可防止Cd在植物組織中過(guò)量積累，同時(shí)可以促進(jìn)植物生物量的增加（表1）。此外，Cd主要積累在根部，轉移到芽上的Cd量極少，這阻礙了芽上出現的Cd誘導的中毒癥狀的發(fā)生，從而有利于植物穩定。
2、 根瘤菌與AMF共接種對Cd脅迫下植物抗性的影響
探究根瘤菌與AMF共接種提高植物抗病性的途徑是揭示接種促進(jìn)生長(cháng)機制的關(guān)鍵。在我們的研究中，接種微生物顯著(zhù)增加了Cd脅迫下紫花苜蓿根際細菌多樣性，降低了真菌多樣性，說(shuō)明共接種有利于細菌群落多樣性的恢復；而添加Cd則不利于真菌群落多樣性的恢復（圖1）。群落多樣性反映了群落的穩定性和功能多樣性，因此，與真菌群落相比，細菌群落對苜?？笴d脅迫的輔助潛力更大。此外，PLS-PM還確定了Cd脅迫下細菌多樣性對抗氧化酶活性和苜蓿生物量的顯著(zhù)正相關(guān)關(guān)系（圖5）。
對于真菌類(lèi)群，在A(yíng)MF接種后，Glomeromycota的相對豐度顯著(zhù)增加（AMF屬于Glomeromycota）（圖2B）。另一方面，Mortierellomycota和 Rozellomycota相對豐度的下降可能是由于 Glomeromycota相對豐度的增加所致（圖 S1B）。因此，在根瘤菌和AMF共同接種后，這些細菌類(lèi)群（增加的類(lèi)群包括Proteobacteria、Actinobacteria、Acidobacteria和Chloroflexi，減少的類(lèi)群包括Bacteroidetes和Firmicutes）和真菌類(lèi)群（增加的分類(lèi)群包括Glomeromycota，減少的分類(lèi)群包括Mortierellomycota和Rozellomycota）可能是提高紫花苜蓿對Cd抗性的關(guān)鍵根際微生物區系。
以往的研究表明，許多微生物類(lèi)群，即Proteobacteria、Actinobacteria、Acidobacteria和Chloroflexi(如Acidobacteria(GP1、GP3和GP6)、Rhizobiales、Burkholderiales、Pseudomonadales和Frankineae)可以幫助植物吸收養分，提高植物生產(chǎn)力。例如，S.meliloti可以誘導根瘤菌占據豆科植物的結節，以幫助養分吸收。有研究表明，根瘤菌也可能提供病害保護，在提供養分的根瘤菌占主導地位的根三葉植物的微生物組，被細菌屬富集。一項研究表明，根瘤菌也可能提供疾病保護，在三葉草屬的微生物組中，提供養分的根瘤菌占主導地位，這些微生物群由細菌屬富集。此外，已知許多細菌可以緩解鐵(Fe)、磷(P)、鎂(Mg)和鈣(Ca)的缺乏，從而防止它們因重金屬競爭而轉移到植物根部。這些過(guò)程還可以通過(guò)增加根際中微量元素的利用率來(lái)促進(jìn)紫花苜蓿的生長(cháng)。因此，提高紫花苜蓿對Cd脅迫抗性的關(guān)鍵細菌類(lèi)群的主要過(guò)程可能是它們?yōu)樽匣ㄜ俎Ｌ峁┝宋崭H營(yíng)養物質(zhì)并減少植物光合作用衍生的碳（C）釋放到土壤中的輔助作用（圖5）。
與細菌群落相反，VPA顯示真菌群落對土壤變量的影響較小(圖4A和B)，這與我們的結果一致，即除Olsen-P和pH值外，真菌群落與根際中的SOC和養分沒(méi)有很強的相關(guān)性(圖4C)。我們的結果表明，真菌群落在提高紫花苜?？笴d脅迫方面的相關(guān)效果低于細菌群落。這些結果也被發(fā)現的關(guān)鍵真菌類(lèi)群和根際變量之間的微弱相關(guān)性所支持（圖4E）。但是，由AMF接種引起的這些關(guān)鍵真菌類(lèi)群的變化強烈影響了關(guān)鍵細菌類(lèi)群，這表明這些關(guān)鍵真菌類(lèi)群可能通過(guò)影響細菌群落的方式在Cd脅迫下輔助苜蓿生長(cháng)中發(fā)揮間接作用。這些結果也闡明了根瘤菌和AMF共同接種與單獨接種相比促進(jìn)苜?？剐院蜕L(cháng)的原因。通過(guò)PLS-PM分析（圖5），關(guān)鍵的真菌類(lèi)群對關(guān)鍵的細菌類(lèi)群有直接影響，這對植物的抗性和生長(cháng)有間接的有利影響。一般來(lái)說(shuō)，在根瘤菌和AMF共同接種處理下，根瘤菌群落而非相應的真菌群落主要提高了紫花苜蓿對Cd脅迫的抗性。
結論
對共生微生物如何影響根際微生物類(lèi)群以協(xié)助苜蓿抵御Cd脅迫提供了新的認識，根際群落成員間的相互作用或接種后群落組合的動(dòng)態(tài)是重要因素。與單一接種相比，根瘤菌和AMF聯(lián)合接種對苜?？笴d脅迫的綜合效應最大。根瘤菌和AMF共接種對主要細菌類(lèi)群產(chǎn)生強烈影響，主要通過(guò)幫助植物從根際吸收養分和減少植物光合作用產(chǎn)生的C分配到土壤中來(lái)提高苜蓿對Cd脅迫的抗性。這些研究結果對進(jìn)一步提高植物的抗逆性，保證牧草和作物的生產(chǎn)具有重要意義。
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