Nanopore三代測序助力人基因組結構變異檢測、HLA分型、STR分析

什么是“人—三代重測序”？

“人—三代重測序”是指基于三代測序技術(shù)對樣品進(jìn)行人全基因組測序，利用獲得的10kb~20kb長(cháng)reads與人參考基因組進(jìn)行比對分析，可以精準開(kāi)發(fā)得到樣品與參考基因組或者樣品間的DNA序列的遺傳變異，如結構變異（Structural Variation，SV）和拷貝數變異（copy number variations, CNV）等，而這些大片段的序列變異的檢測是二代重測序無(wú)法做到的。

為什么要做“人—三代重測序”？

利用開(kāi)發(fā)得到SV、CNV可以應用到個(gè)體或群體間的差異性分析、疾病或癌癥領(lǐng)域的HLA、STR等研究中。三代重測序以其長(cháng)讀長(cháng)（可直接跨越大片段結構變異；可直接跨越串聯(lián)重復區域、高GC區域、高度同源區域、高度多態(tài)性區域）、無(wú)需PCR擴增（避免PCR擴增引入的錯誤）等優(yōu)勢，成為挖掘人基因組遺傳變異信息的全新策略。

“人—三代重測序”信息分析流程

采用Nanopore測序，將測序得到的原始數據進(jìn)行質(zhì)量評估并過(guò)濾得到Clean?Reads，用于后續的生物信息學(xué)的分析。生物信息分析流程圖如下：

部分分析結果展示

1、數據質(zhì)控

Nanopore測序數據下機后，將其數據轉換為fastq格式，用于后續質(zhì)控分析。原始fastq數據經(jīng)進(jìn)一步過(guò)濾接頭、過(guò)濾短片段、過(guò)濾低質(zhì)量reads后，得到總的數據集。

2、變異檢測

基因組結構變異，SVs，通常指的是長(cháng)度大于50bp的大片段結構變異，包括許多類(lèi)型，如缺失（DEL）、插入（INS）、重復（DUP）、倒位（INV）、拷貝數變異（CNV）等，它們在個(gè)體和群體水平上促進(jìn)了人類(lèi)基因組的多樣性和進(jìn)化。相比SNP，SVs在變異基數中所占比例更多，對基因組的影響更大，一旦發(fā)生變化，往往會(huì )給生命體帶來(lái)重大影響。越來(lái)越多的證據表明，SVs與許多人類(lèi)疾病有關(guān)，如神經(jīng)發(fā)育疾病、心血管疾病和癌癥等。因此，系統地分析人類(lèi)基因組中的 SVs 對于生物學(xué)和臨床研究至關(guān)重要。

本次分析采用長(cháng)讀長(cháng)納米孔測序，更有可能涵蓋整個(gè)結構變異體和/或重復區域，從而獲得更加準確的結構變異體，加深對結構變異以及結構變異在疾病、進(jìn)化和遺傳多樣性的作用的理解。

3、重復序列分析

微衛星標記（microsatellite），又被稱(chēng)為短串聯(lián)重復序列（short tandem repeats, STRs）或簡(jiǎn)單重復序列（simple sequence repeats, SSRs），是均勻分布于真核生物基因組中的簡(jiǎn)單重復序列，由2～6個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復片段（核心序列）串聯(lián)重復組成，其重復單位的重復次數在個(gè)體間呈高度變異性并且數量豐富。目前已發(fā)現重復序列和40多種神經(jīng)肌肉和神經(jīng)退行性疾病等疾病有關(guān)，包括眾所熟知的精神發(fā)育遲滯疾病—脆性X染色體、神經(jīng)退行性疾病—亨廷頓舞蹈癥、脊髓小腦性共濟失調癥等，此外微衛星不穩定性MSI也是許多癌癥基因組特征。由于重復序列的擴張引起的疾病稱(chēng)為重復序列擴張疾病，當然有些重復序列縮短也能引起疾病。其發(fā)病機制與這些重復的微衛星序列的重復次數相關(guān)。利用三代長(cháng)讀長(cháng)數據，可用來(lái)檢測衛星序列重復次數。

4、HLA分型

主要組織相容性復合體MHC區域位于6號染色體的短臂上，是人類(lèi)基因組上*復雜的區域之一（約4Mb），呈現出高度的多態(tài)性（有著(zhù)超過(guò)10,000個(gè)等位）。其編碼的分子參與抗原遞呈，制約細胞間相互識別及誘導免疫應答。人類(lèi)白細胞抗原（HLA）編碼基因是 MHC 的一部分，是迄今已知基因中等位基因多態(tài)性*高的基因復合體，也是不同個(gè)體進(jìn)行器官或組織細胞移植時(shí)發(fā)生排斥的主要成分。

與 HLA 相關(guān)的疾病多達100多種，涉及自身免疫性疾病、免疫缺陷性疾病、過(guò)敏性疾病、感染類(lèi)疾病、代謝性疾病等，如糖尿病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節炎，銀屑病、強直性脊柱炎、重癥肌無(wú)力和哮喘等。同時(shí)，HLA在器官和骨髓等移植中起到至關(guān)重要的作用，也與許多藥物的嚴重不良反應相關(guān)。因此，進(jìn)行HLA 分型，有利于免疫相關(guān)疾病的研究、疫苗和藥物靶向人群篩選、種族進(jìn)化的研究、組織和器官移植等。

本次分析對樣品的 HLA-A，HLA-B，HLA-C 基因進(jìn)行單倍型鑒定。將測序的Nanopore?reads與已知的HLA等位比對來(lái)識別候選的等位，接下來(lái)通過(guò)與候選等位的多重比對獲取一致序列，最后通過(guò)將一致序列與參考數據庫比對獲取每個(gè)樣品最終的單倍型。

總結

（1）通過(guò)三代重測序對人基因組進(jìn)行SV、CNV等變異檢測，系統分析人全基因組的結構變異。

（2）三代測序技術(shù)讀長(cháng)長(cháng)，可輕松跨越基因組低復雜度區域，且無(wú)GC偏好性，利用三代長(cháng)讀長(cháng)數據，更有利于檢測STRs。

（3）二代測序技術(shù)受讀長(cháng)的限制，會(huì )導致 HLA 分型數據不明確，三代測序憑借其長(cháng)讀長(cháng)特點(diǎn)，能夠顯著(zhù)提高HLA分型的準確性。

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