單細胞測序揭示擬南芥野生型和scr突變體根細胞的不同發(fā)育軌跡

明星基因SHR、SCR又發(fā)《Cell》子刊了？這到底是怎么一回事呢？今天的文獻分享就告訴您~

研究背景

多細胞生物通過(guò)控制的轉錄網(wǎng)絡(luò )明確細胞特性，關(guān)聯(lián)位置信息，協(xié)調器官的發(fā)育和成熟。明確這些網(wǎng)絡(luò )如何協(xié)調器官的發(fā)育和功能，需要詳細地理解該組織器官的時(shí)空基因表達模式。擬南芥的根是一個(gè)易于操作的模式器官，具有大多數細胞類(lèi)型的標記，以及形態(tài)學(xué)定義的發(fā)育階段。有利于進(jìn)行器官發(fā)育過(guò)程中的基因時(shí)空表達模式的研究。盡管，此前已有一些研究單位報道擬南芥單細胞測序圖譜，但是這些一代圖譜中沒(méi)有一個(gè)使用超過(guò)12,500個(gè)細胞。而且僅有一個(gè)研究單位推斷了三種以上細胞類(lèi)型的發(fā)育進(jìn)程。因此，目前還沒(méi)有一個(gè)全面的擬南芥根系圖譜，可以捕捉到所有主要細胞類(lèi)型的發(fā)育狀態(tài)的細微變化。

研究材料

材料：擬南芥野生型(?Col-0?)?96,000個(gè)根細胞(13個(gè)樣本)，scr突變體10,000個(gè)根細胞(n=2)，shr突變體10,000個(gè)根細胞(n=2)。

方法：?jiǎn)渭毎D錄組測序、碘化丙啶（PI）染色

主要結果

1.?構建擬南芥根的scRNA-seq圖譜，注釋細胞類(lèi)型和發(fā)育階段

為了繪制一個(gè)全面的、器官尺度的擬南芥單細胞分辨率圖譜。作者選取5-7日齡的野生型幼苗主根尖0.5?cm的組織進(jìn)行取樣，制備原生質(zhì)體，使用10X?Genomics?scRNA-seq平臺對超過(guò)96,000個(gè)根細胞進(jìn)行了分析。之后結合已發(fā)表的scRNA-seq相關(guān)數據（3個(gè)樣本14,427個(gè)細胞），最終構建了單細胞水平上的十萬(wàn)級根細胞時(shí)空表達圖譜。數據統計顯示，每個(gè)細胞平均檢測出2,768個(gè)基因，總計24,997個(gè)基因，占擬南芥基因組中編碼基因的90%。作者推斷出jing q 的細胞類(lèi)型注釋?zhuān)瑢⒚總€(gè)細胞分配到14個(gè)細胞類(lèi)型和7個(gè)發(fā)育階段。之后，作者結合novoSpaRc、SEMITONES、ICI（index?of?cell?identity）等方法，通過(guò)每個(gè)細胞的表達譜來(lái)確定細胞類(lèi)型和發(fā)育階段之間的邊界（圖1、圖2）。

2.?通過(guò)各個(gè)組織類(lèi)型來(lái)推斷發(fā)育進(jìn)程

為了更詳細地分析根的各個(gè)細胞的發(fā)育進(jìn)程，作者從注釋的細胞系內的簡(jiǎn)單擬時(shí)序分析開(kāi)始，基于干細胞的起源將圖譜細分成4個(gè)組織/細胞系群。并使用兩種不同方法的非圖形工具CytoTRACE和scVelo來(lái)量化細胞的分化進(jìn)程。通過(guò)將擬時(shí)間順序劃分為10組（T0-T9）進(jìn)行差異表達分析，確定了基因的動(dòng)態(tài)表達隨著(zhù)皮層和內皮層的分化循序漸進(jìn)（圖3）。同樣，在中柱細胞、表皮、側根冠細胞（LRC）和中軸細胞之間，基因也呈現出重疊漸進(jìn)的表達模式。

3.理想傳輸理論確定發(fā)育軌跡

由于擬時(shí)序推理表明根細胞類(lèi)型以不同的速率成熟，于是作者利用基于理想傳輸理論OT（Optimal?Transport）的StationaryOT分析方法來(lái)推斷整個(gè)圖譜的發(fā)育軌跡。研究人員發(fā)現它可以在很大程度上獨立于圖譜注釋和細胞系分割，來(lái)推斷細胞系的發(fā)育軌跡，反映每種細胞和組織類(lèi)型分化的現有生物學(xué)知識。分化事件可以通過(guò)將多個(gè)命運概率以“三角圖”的形式投影到重心坐標中來(lái)實(shí)現可視化。作者利用“三角圖”分別展現了分生區、伸長(cháng)區、成熟區的內皮層和皮層細胞的命運概率（圖4D-F）。已知內皮層標記基因SCARECROW?(SCR)?和MYB36的表達模式與伴隨細胞成熟而不斷增加的內皮層命運概率相一致（圖4G）。之后按照發(fā)育區對生毛細胞、非生毛細胞（圖4J-L），中柱鞘、原形成層（圖4O-Q）也繪制“三角圖”。此外，理想傳輸理論也有助于識別發(fā)育調節因子。

4.scRNA-seq揭示scr突變體的分化途徑

在根的發(fā)育過(guò)程中，轉錄因子SHORTROOT?(SHR)?和SCR對干細胞龕維持和組織模式形成至關(guān)重要。那么，SHR或SCR的功能喪失會(huì )如何影響組織構成以及根細胞的特性和分化呢？由于shr和scr突變體都缺乏形成基本組織的不對稱(chēng)細胞分裂，導致形成了一個(gè)單一的突變體組織層，而不是皮層和內皮層細胞層。與先前組織特異性標記與形態(tài)檢測的突變體表型一致，通過(guò)對shr和scr突變體細胞的scRNA-seq數據分析發(fā)現，它們中表達內皮層marker基因的細胞顯著(zhù)減少。兩個(gè)突變體原生木質(zhì)部細胞的豐度也明顯下降了，并且shr中原生韌皮部和初生韌皮部細胞豐度下降，這與shr和scr中柱缺陷的表型一致。此外，該研究發(fā)現木質(zhì)部和韌皮部中柱鞘細胞（pericycle?cell）對應的基因表達也下調了；這一結果與shr突變體影響側根發(fā)育一致（圖5）。

5.scRNA-seq表明scr突變層的轉分化

接下來(lái)，一個(gè)值得思考的問(wèn)題是單一細胞是如何對報告的scr突變體層的混合特性做出貢獻的？從單一細胞的發(fā)育軌跡來(lái)說(shuō)，造成這種混合特性的可能性有多種。1）細胞在發(fā)育早期獲得了內皮層和皮層的身份，而突變層是將兩種細胞類(lèi)型的異質(zhì)性混合；2）每個(gè)細胞可能具有皮層和內皮層的混合屬性；3）細胞在發(fā)育早期只獲得一種特性，隨后改變其命運。通過(guò)StationaryOT分析來(lái)計算scr細胞的命運概率最終發(fā)現scr突變層細胞同時(shí)具有皮層和內皮層的特性。有意思的是，scr突變層細胞在發(fā)育早期（分生區）主要是類(lèi)似皮層，而成熟區的細胞呈現出內皮層的特性（圖6-1）。

為了在體內進(jìn)一步對scRNA-seq得到的結論進(jìn)行驗證，作者驗證了皮層和內皮層標志物的空間表達模式在scr突變層是否會(huì )發(fā)生改變。在WT中，內皮層標志基因MYB36和皮層轉錄報告基因AT1G09750?(CORTEX)在它們各自類(lèi)型的伸長(cháng)區表達，MYB36在分生區的內皮層也表達。但scr突變體中，MYB36轉錄報告基因的表達僅在晚期延伸區和成熟區可見(jiàn)，皮層轉錄報告基因在延伸區和成熟區都有所減少（圖6-2）。以上結果都與scRNA-seq分析結果一致。

總結

這篇文章通過(guò)對不同發(fā)育階段的擬南芥根細胞進(jìn)行scRNA-seq，構建了十萬(wàn)級水平的根細胞基因時(shí)空表達圖譜，并利用理想傳輸理論（OT）推斷出了細胞系的發(fā)育軌跡。同時(shí)，通過(guò)比較scr和shr突變體的scRNA-seq數據，從單細胞水平闡釋了scr突變層細胞同時(shí)具有皮層和內皮層混合特性，并指出了其發(fā)育軌跡上的特性轉變。最后，使用內皮層和皮層轉錄報告基因對以上結論進(jìn)行了體內驗證。

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