1、前言
1.1 適用范圍
本指南介紹百邁客實(shí)驗平臺空間轉錄組產(chǎn)品的送樣要求及制備方法，采集送樣前請詳細閱讀。
1.2 聲明
我國法定的傳染病分為三大類(lèi)：甲類(lèi)（一類(lèi)）傳染病包括霍亂和鼠疫；乙類(lèi)（二類(lèi)）傳染病包括傳染性非典肺炎、新型冠狀病毒 (2019-nCoV)肺炎、艾滋病、病毒性肝炎、人感染高致病性禽流感、脊髓灰質(zhì)炎、麻疹、流行性出血熱、狂犬病、登革熱、流行性乙型肝炎、細菌性和阿米巴性痢疾、肺結核、傷寒和副傷寒、炭疽、流行性腦脊髓膜炎、白喉、百日咳、新生兒破傷風(fēng)、猩紅熱、布魯士病、梅毒、淋病、鉤端螺旋體病、血吸蟲(chóng)、瘧疾。丙類(lèi)（三類(lèi)）傳染病包括流行性感冒、流行性腮腺炎、流行性和地方性斑疹、傷寒、風(fēng)疹、麻風(fēng)病、急性出血性結膜炎、黑熱病、絲蟲(chóng)病、包蟲(chóng)病、還有除了霍亂、細菌、阿米巴性痢疾、傷寒和副傷寒以外的感染性腹瀉。
涉及上述傳染病的科學(xué)研究需符合國家的相關(guān)規定，為嚴格遵守國家法律法規，本著(zhù)對社會(huì )及相關(guān)操作人員負責的態(tài)度，我司要求客戶(hù)方真實(shí)準確地提供樣品的生物安全性信息，對樣品是否含有上述感染性病原體進(jìn)行事先說(shuō)明。樣品中含有上述感染性病原體時(shí)，客戶(hù)方需要提供符合生物安全等級要求的實(shí)驗室以便開(kāi)展相關(guān)實(shí)驗，實(shí)驗進(jìn)行時(shí)，客戶(hù)方有義務(wù)協(xié)助我方實(shí)驗員做好實(shí)驗安全防護?？蛻?hù)方不得隱瞞樣品的生物安全性信息，若出現樣品含有感染性病原體而客戶(hù)事先未告知我司的情況，一經(jīng)發(fā)現我司將停止進(jìn)行相關(guān)項目，已產(chǎn)生的費用由客戶(hù)方承擔。如因客戶(hù)方提供的生物安全性信息不實(shí)、隱瞞樣品感染性等有關(guān)情況等造成實(shí)驗員及相關(guān)人員被感染、疾病傳播等嚴重后果的，我司將按規定報告國家相關(guān)部門(mén)，并將通過(guò)法律等手段追究相關(guān)責任。
2、項目流程
目前百邁客空間轉錄組測序服務(wù)模式默認為組織寄送模式，如果有特殊情況需要上門(mén)服務(wù)，請與百邁客技術(shù)人員確認實(shí)驗室儀器設備情況。
組織寄送前請至少提前1周進(jìn)行預約，百邁客接收到樣本并確認樣本無(wú)異常后，3-5天內安排RNA質(zhì)檢并反饋質(zhì)檢結果，質(zhì)檢合格后安排切片、組織結構確認與透化。
圖 1 百邁客新鮮冷凍樣本空間轉錄組服務(wù)流程
3、新鮮冷凍樣本
3.1 樣本要求
10x空間轉錄組每塊組織樣本長(cháng)寬不宜超過(guò)6.5*6.5mm，百創(chuàng )S3000空間轉錄組每塊組織樣本長(cháng)寬不宜超過(guò)6.8*6.8mm，厚度＞1.5mm，S2000A空間轉錄組每塊組織樣本長(cháng)寬不宜超過(guò)11*11mm，組織截面覆蓋小于25%的組織，建議多個(gè)包埋成一個(gè)OCT包埋塊，組織間隔盡量小，但是不要重疊，多個(gè)組織保持在一個(gè)水平面充分利用捕獲區域。
注1：在樣本量足夠的情況下，每個(gè)動(dòng)物樣本最好準備至少2個(gè)包埋塊，1份用于RNA質(zhì)檢（切片質(zhì)控標準見(jiàn)第3部分）、切片選片、上透化芯片和表達芯片，另1份用做備份，避免因樣本異常等特殊情況需要重新送樣而耽誤項目周期。
注2：在樣本量足夠的情況下，每個(gè)植物樣本最好準備至少3個(gè)包埋塊，因植物組織目的結構較薄，實(shí)驗建議進(jìn)行全流程方案進(jìn)行空間實(shí)驗，即一個(gè)包埋塊在一次切片實(shí)驗中完成結構確認，貼片表達，貼片透化，避免反復切片導致結構損失，其余2塊用做備份，避免因樣本異常等特殊情況需要重新送樣而耽誤項目周期。
3.2 樣本采集與運輸
3.2.1 采集前準備
- 所有器械和環(huán)境需要消毒滅菌，所有器械（如剪刀、鑷子等）需要冰上預冷；
- 在醫用托盤(pán)上放一層冰，然后覆蓋上一層錫箔紙，再鋪幾層無(wú)菌布，將個(gè)體放在無(wú)菌布上進(jìn)行取樣，保持整個(gè)取樣過(guò)程在低溫中進(jìn)行，可以延緩核酸的降解，（動(dòng)物組織建議針對活體或剛死亡個(gè)體進(jìn)行解剖取樣）；
- 動(dòng)物組織如果取樣后無(wú)法立即進(jìn)行后續包埋實(shí)驗，可以將樣本清理干凈后，暫時(shí)放入組織保護液（美天旎，貨號130-100-008）或DPBS或生理鹽水中并置于4℃冰箱暫存，暫存時(shí)間最長(cháng)不要超過(guò)5h，以免造成RNA降解，RIN值質(zhì)檢不合格；
- 使用指定品牌的OCT（櫻花牌-4583）或OCT（leica-FSC 22）進(jìn)行包埋，OCT使用前在冰上預冷30分鐘。
3.2.2 動(dòng)物樣本采集
- 取下新鮮組織，立即剔除結締組織和脂肪組織等非研究所需的組織類(lèi)型，對腫瘤組織的取材，應盡可能準確地判定腫瘤和正常組織，腫瘤組織應將周?chē)恼＝M織切除干凈（正常組織也應將周?chē)哪[瘤組織切除干凈）；
- 迅速用預冷的 PBS溶液（RNase?free）或生理鹽水將組織表面的殘留血液沖洗干凈，然后用無(wú)菌紗布吸凈表面液體；
- 如果組織體積較大，需要將組織切成長(cháng)寬＜5*6.5mm（10x Genomics）/6.8*6.8mm（百創(chuàng )S3000）的小塊，用7*7*5mm的特小號包埋盒進(jìn)行包埋；取下的組織應立即進(jìn)行后續包埋實(shí)驗。
注：原則上實(shí)驗室不提供組織冷凍包埋相關(guān)試劑，需客戶(hù)網(wǎng)上自行購買(mǎi)，如有需要請聯(lián)系運營(yíng)確認實(shí)驗室是否有存貨，因 OCT 試劑無(wú)法分裝運送，實(shí)驗室也僅僅可提供包埋盒。
3.2.3?植物樣本采集
- 培養基培養樣本：在無(wú)菌超凈臺中取出組織，去除組織表面附著(zhù)的培養基，用超純水將組織表面清洗干凈。從活體植株上取下新鮮目標區域組織置于培養皿中，利用4℃預冷的鑷子和剪刀將目標區域外的組織結構盡量去除，若組織內部存在空腔盡可能修剪組織暴露空腔，之后將組織裁剪成＜5*6.5mm（10x Genomics）/6.8*6.8mm（百創(chuàng )S3000）的小塊；
- 土壤培養樣本：將組織從培養土中完整取出，去除土壤及雜質(zhì)，用超純水將組織表面土壤及雜質(zhì)徹底清洗干凈。從活體植株上取下新鮮目標區域組織置于培養皿中，利用4℃預冷的鑷子和剪刀將目標區域外的組織結構盡量去除，若組織內部存在空腔盡可能修剪組織暴露空腔，之后將組織裁剪成＜5*6.5mm（10x Genomics）/6.8*6.8mm（百創(chuàng )S3000）的小塊；
- 將目標組織按照不同組織類(lèi)型包埋方法進(jìn)行包埋
注：原則上實(shí)驗室不提供組織冷凍包埋相關(guān)試劑，需客戶(hù)網(wǎng)上自行購買(mǎi)，如有需要請聯(lián)系運營(yíng)確認實(shí)驗室是否有存貨，因 OCT 試劑無(wú)法分裝運送，實(shí)驗室也僅僅可提供包埋盒。
3.2.4?動(dòng)物組織速凍包埋
下文提供了2種包埋方法：干冰包埋法、異戊烷+液氮包埋法，客戶(hù)可根據實(shí)驗條件進(jìn)行選擇。干冰包埋法適合更多的組織類(lèi)型，是最常用的包埋方法，也可以得到較好的切片結果；異戊烷+液氮包埋法，可以快速降溫，保護細胞完整性，但操作較復雜，而且異戊烷對人體有一定的健康危害，一些較小、較輕的樣本如穿刺樣本推薦使用液氮+異戊烷的方法進(jìn)行冷凍包埋。
方法1干冰包埋法（常用）
無(wú)需異戊烷，直接用干冰粒進(jìn)行包埋。
- 將新鮮組織置于培養皿中，用干凈的紗布或者紙巾吸干組織周?chē)?，盡量使組織表面干燥；
- 標記包埋盒（樣本名稱(chēng)、樣本方向、包埋日期等，一定在冷凍之前，對包埋盒做標記，一旦冷凍包埋盒將很難標記信息）；
- 將包埋盒轉移到冰上，在包埋盒中注入預冷OCT，注入量為包埋盒高度的1/4-1/3，避免產(chǎn)生氣泡；
- 冰上預冷鑷子，將組織放入OCT中，調整好方向，用OCT覆蓋任何裸露組織的表面，確認沒(méi)有氣泡，尤其是在組織附近，如果有氣泡可用移液槍將氣泡移除，以免影響組織切片形態(tài)結構（此步需要拍照記錄，OCT冷凍后會(huì )變白，將很難確定組織的方向）；
- 將包含組織和OCT的包埋盒放在干冰粒上輕輕按壓（如下圖，左），確保水平（否則會(huì )影響組織的方向，同時(shí)能保證干冰粒與包埋塊的接觸面積最大以達到快速降溫的效果），直到包埋塊完全凍結變白（如下圖，右）。
- 將 OCT 包埋的組織塊和包埋盒用錫紙包裹好，做好樣本標記，直接保存在–80℃的密封容器中，利用干冰運輸。
方法2?異戊烷+液氮包埋法
腦組織等容易形成冰晶或者水腫病變組織推薦使用此方案進(jìn)行包埋。
- 用異戊烷（足以完全浸沒(méi)組織）填充三分之二的金屬燒杯，然后放入液氮杜瓦瓶中（液氮與異戊烷保持相同的水平面）以充分接觸，孵育15分鐘；
- 將新鮮組織置于培養皿中，用干凈的紗布或者紙巾吸干組織周?chē)?，盡量使組織表面干燥；
- 標記包埋盒（樣本名稱(chēng)、樣本方向、包埋日期等，一定在冷凍之前，對包埋盒做標記，一旦冷凍包埋盒將很難標記信息）；
- 將包埋盒轉移到冰上，在包埋盒中注入預冷OCT，注入量為包埋盒高度的1/4-1/3，避免產(chǎn)生氣泡；
- 冰上預冷鑷子，將組織放入OCT中，調整好方向，用OCT覆蓋任何裸露組織的表面，確認沒(méi)有氣泡，尤其是在組織附近，如果有氣泡可用移液槍將氣泡移除。以免影響組織切片形態(tài)結構（此步需要拍照記錄，OCT冷凍后會(huì )變白，將很難確定組織的方向）；
- 用鑷子將包埋盒放到異戊烷上，不要使異戊烷浸入包埋盒內，直到組織凍結，冷凍時(shí)間可根據組織類(lèi)型和大小而變化（如下圖）；
- 將 OCT 包埋的組織塊和包埋盒用錫紙包裹好，做好樣本標記，直接保存在–80℃的密封容器中 ，利用干冰運輸。
3.2.5 植物組織速凍包埋
下文提供了 3 種包埋方法，根據植物組織的部位不同，我們推薦了不同的包埋方式：
包埋方法
| 組織類(lèi)型 | 推薦的包埋方法 |
| 幼芽、花苞、籽粒、莖（中空結構） | 方法一 |
| 側根、根尖、葉片、愈傷組織 | 方法二 |
| 主根、莖、幼果（含水量大） | 石蠟包埋 |
方法一?：抽真空+干冰冷凍OCT包埋（不需要固定）
1）按照2.3植物采樣方法裁取樣本，空隙較多組織（花苞、莖尖）需將組織部分切開(kāi)，目標區域外組織需盡可能全部去除。
2）將植物組織浸泡在1ml 05%吐溫20中,室溫15min。
3）冰上預冷75% OCT包埋劑溶液（5mlOCT+2.5ml滅菌水顛倒混勻），1.5ml離心管中加入1ml 75%OCT，將植物組織浸潤在其中，將平底的無(wú)吸附膜的吸附柱放入1.5ml離心管中，以防止抽真空過(guò)程組織上浮在OCT表面，打開(kāi)所有管蓋，置于真空濃縮儀中（注意配平）。室溫抽真空10min，摸索設置成V-AQ，促進(jìn)OCT溶液充分包裹和進(jìn)入組織空隙中，保證OCT填充包埋組織的完整性。如下圖：
4）將包埋盒放置在冰上 ，標記包埋盒（組織放置的方向 、樣品名稱(chēng)等）（可拍照記錄），在包埋盒底部加入適量的OCT包埋劑，約1/4深度 ，防止組織沉底直接接觸包埋盒底部 。
5）在冰上用鑷子輕輕夾住組織，輕輕擦拭表面的OCT，緩慢放入預冷的含OCT的包埋盒中 ，加預冷的OCT直至完全包裹組織，并調整組織在OCT中的位置 ，保證目標平面與切面水平一致，如果多個(gè)組織包埋在一起時(shí)一定要將組織放置于包埋盒的中部排列整齊 ，避免重疊在一起，此過(guò)程中避免產(chǎn)生氣泡，如有氣泡產(chǎn)生用用針尖輕緩挑出氣泡或用200 μl槍頭吸出氣泡。
6）將包含組織和OCT的包埋盒放在干冰粒上輕輕按壓（如下圖，左），確保水平（否則會(huì )影響組織的方向，同時(shí)能保證干冰粒與包埋塊的接觸面積最大以達到快速降溫的效果），直到包埋塊完全凍結變白（如下圖，右）。
7）將 OCT 包埋的組織塊和包埋盒用錫紙包裹好，做好樣本標記，直接保存在–80℃的密封容器中，利用干冰運輸。
方法二?：直接冷凍OCT包埋（無(wú)需抽真空）
- 按照2.3植物采樣方法裁取樣本
- 將植物組織浸泡在1ml 05%吐溫20中,室溫15min。
- 將包埋盒放置在冰上 ，標記包埋盒（組織放置的方向 、樣品名稱(chēng)等）（可拍照記錄），在包埋盒底部加入適量的OCT包埋劑，約1/4深度 ，防止組織沉底直接接觸包埋盒底部 。
- 在冰上用鑷子輕輕夾住組織 ，緩慢放入預冷的OCT包埋劑中 ，直至OCT完全包裹組織。
- 調整組織在OCT中的位置，盡量將組織放置于包埋盒的中部，保證目標平面與切面水平一致。如果多個(gè)組織包埋在一起時(shí)一定要將組織放置于包埋盒的中部排列整齊 ，避免重疊在一起 ， 此過(guò)程中避免產(chǎn)生氣泡，如有氣泡產(chǎn)生用用針尖輕緩挑出氣泡或用200 μl槍頭吸出氣泡。
- 用異戊烷（足以完全浸沒(méi)組織）填充三分之二的金屬燒杯，然后放入液氮杜瓦瓶中 （液氮與異戊烷保持相同的水平面）以充分接觸，孵育5- 10分鐘，時(shí)間不宜太久，防止異戊烷凝結 。（若無(wú)異戊烷及液氮可使用干冰包埋）
- 用鑷子夾住包埋盒置于預冷的液氮-異戊烷浴上（避免模具被異戊烷浸沒(méi)）或干冰上，然后等待OCT凝固變白。
- 將 OCT 包埋的組織塊或者包埋盒用錫紙包裹好，直接保存在–80℃的密封容器中 ，做好樣本標記，利用干冰運輸。
方法三?：石蠟包埋
石蠟包埋請使用百邁客專(zhuān)用試劑盒(試用裝)，此試劑盒適用于主根、莖、幼果（含水量大）等組織類(lèi)型，OCT切片破碎的組織也可以使用此試劑盒嘗試包埋切片。
詳細操作步驟請查看試劑盒說(shuō)明書(shū)（此試劑盒目前為試用裝，未正式發(fā)布，有需求可溝通銷(xiāo)售）
3.2.6?樣本寄送運輸
包埋后的組織用錫箔紙包住，放入密封袋中密封，放入樣本盒在液氮或者-80℃冰箱長(cháng)期保存，或者放置在干冰上進(jìn)行冷凍運輸，寄送到百邁客實(shí)驗室，干冰寄送推薦用量約5kg/日。
不規范送樣示例：
A.包埋時(shí)組織放置靠近最下層，組織未被OCT包裹，導致樣本RNA降解，質(zhì)檢不合格；
B.組織暴露在空氣中，導致樣本降解，組織兩側無(wú)OCT支撐，展片時(shí)可能會(huì )破壞樣本結構；
C.組織較小，不滿(mǎn)足做表達最小25%的要求；
D.同一個(gè)包埋塊包埋了多個(gè)樣本，但不在同一個(gè)平面，并且每一個(gè)樣本組織過(guò)小，覆蓋區域有限，可能導致分析有效數據偏低。
3.3?切片質(zhì)控標準
- 組織形態(tài)學(xué)檢測：對動(dòng)物組織切片進(jìn)行H&E染色，對植物組織切片進(jìn)行甲苯胺藍染色，觀(guān)察是否獲取到目標區域，組織形態(tài)完整性是否在可接受范圍內（例如是否有大的裂痕，存在明顯的空泡、褶皺等）。
- RNA完整性檢測：收取10-15張切片，利用Agilent2100對樣本進(jìn)行RNA完整性檢測，要求RNARIN≥6，則認為樣本完整性滿(mǎn)足實(shí)驗要求，可以進(jìn)行后續實(shí)驗。具體切片質(zhì)檢量如下：
1）10微米切片厚度，組織占包埋塊面積的1/5-1/4，質(zhì)檢量要求~20張（左圖）；
2）10微米切片厚度，組織占包埋塊面積的＞1/3，質(zhì)檢量要求~15張（右圖）。
3.4 測序數據量推薦
測序數據量：10x Genomics推薦60G/樣，百創(chuàng )S3000推薦250G/樣；
測序平臺：SURFSeq?5000
京公網(wǎng)安備 11011302003368號