植物磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)新技術(shù)！—GreenPhos【IF21.949】

期刊名稱(chēng)：Molecular Plant

影響因子：21.949

發(fā)表單位：中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所

研究部位：高等植物及綠色生物

研究方法：磷酸化蛋白質(zhì)組、PRM靶向蛋白組

研究背景

2023年11月27日，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所汪迎春團隊在Molecular Plant在線(xiàn)發(fā)表了題為GreenPhos, a universal method for in-depth measurement of plant phosphoproteomes with high quantitative reproducibility?的研究論文。論文中報道了一種具有突破性的植物磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)新技術(shù)。該技術(shù)采用了簡(jiǎn)化、穩健的工作流程，有效地克服了植物磷酸化蛋白質(zhì)組分析的主要技術(shù)難點(diǎn)，能高靈敏度、高特異性快速地富集植物磷酸肽。利用該技術(shù)可定量分析不同植物的磷酸蛋白質(zhì)組，其分析深度之深、定量重復性之高前所未有，有望成為植物磷酸蛋白組學(xué)的通用技術(shù)。由于該技術(shù)主要面向高等植物及其它綠色生物（如衣藻），且操作簡(jiǎn)便，極大地降低了實(shí)驗所需的人力和試劑費用，因此命名為GreenPhos (綠磷)。

蛋白質(zhì)磷酸化在植物的生長(cháng)、發(fā)育、環(huán)境適應以及作物的產(chǎn)量和品質(zhì)調控中發(fā)揮著(zhù)重要的作用。深度解析磷酸化蛋白質(zhì)組是全面理解磷酸化如何行使功能的有效手段。然而，與動(dòng)物相比，植物磷酸化蛋白質(zhì)組的深度解析在技術(shù)上更具挑戰性。因為植物細胞具有致密的細胞壁和大量的包括色素在內的次生代謝物，前者極大地增加了蛋白質(zhì)提取的難度，而后者嚴重地干擾了磷酸肽富集的效率和特異性。

實(shí)驗材料

野生型擬南芥(Col-0)幼苗在10%漂白劑中表面消毒，在無(wú)菌去離子水中漂洗，然后播種在含有1%瓊脂，pH為5.8的半強度Murashige和Skoog (1/2 MS)培養基上。種子在4℃的黑暗條件下發(fā)芽2天。幼苗在1/2 MS固體培養基上生長(cháng)10天，然后轉移到1/2 MS液體培養基上，再培養16小時(shí)。在鹽脅迫實(shí)驗中，將幼苗轉移到添加或不添加(對照) 100mM NaCl的新鮮培養基中，根據需要孵育30 min或120 min。

研究結果

1.GreenPhos的開(kāi)發(fā)——一種穩定高效的純化植物磷酸肽的方法

從植物組織中高效提取蛋白質(zhì)是深入分析植物蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組的第一步和關(guān)鍵一步。為此，作者比較了SDS、GdnHCl和SDC等不同變性劑對擬南芥葉片中蛋白質(zhì)的提取性能。結果發(fā)現SDS-和SDC-提取的蛋白的性能相似，但優(yōu)于GdnHCl。植物樣品相較于動(dòng)物樣品含有較低濃度的蛋白質(zhì)，因此作者優(yōu)化了磷酸化蛋白質(zhì)組的提取和富集的方法，即用SDS或GdnHCl緩沖液提取的蛋白質(zhì)樣品，在蛋白質(zhì)消化和隨后的磷酸肽富集之前，必須去除變性劑(圖1A)。接著(zhù)用氯仿-甲醇沉淀提取的樣品，去除變性劑和其他干擾生物分子(圖1A和1B)。而作者通過(guò)實(shí)驗發(fā)現，SDC法提取的蛋白樣本不需要經(jīng)過(guò)氯仿-甲醇沉淀，而鑒定到的磷酸化蛋白更多，同時(shí)需要的植物材料更少。因此作者認為SDC法更節省成本達到更好的效果，并在番茄、水稻、綠藻等生物中得到驗證，從而確定了磷酸化蛋白組學(xué)的方法，稱(chēng)之為GreenPhos。

2.?GreenPhos與當前磷酸肽富集方法的比較

GreenPhos與當前基于polyMAC的磷酸肽制備方法相比，在上機蛋白等量的情況下，GreenPhos方法平均鑒定出11072個(gè)磷酸化位點(diǎn)，而polymac法鑒定出9399個(gè)磷酸化位點(diǎn) (圖2B)，表明GreenPhos的分析深度比PolyMAC的高18%，并且需要的樣本量更少，省去了更多的實(shí)驗步驟和時(shí)間。與此同時(shí)，作者發(fā)現GreenPhos的富集選擇性(92%)也高于PolyMAC的富集選擇性(54%)（圖2C）?？赡茉蚴谴紊x物的存在影響了磷酸肽對TiO2珠的親和力，PolyMAC優(yōu)先富集磷酸化肽，而GreenPhos富集了更多的雙重或多重磷酸化肽(圖2D-E)?？傊?，在當前實(shí)驗條件下，GreenPhos優(yōu)于基于polyMAC的方法。

3.GreenPhos的靈敏度和定量性能

為了進(jìn)一步測試GreenPhos的效率和靈敏度，作者從擬南芥葉片中提取蛋白質(zhì)(100、300、600和900μg)，分別從4個(gè)樣品中分別富集磷酸肽，并通過(guò)LC-MS分析（圖3A）。通過(guò)比較鑒定出的磷位點(diǎn)和磷酸肽的數量，發(fā)現兩者都隨著(zhù)上機量的增加而增加，達到600μg后鑒定出的磷酸化位點(diǎn)和磷酸化肽的小幅增加 (圖3A和3B)。說(shuō)明鑒定的磷酸化位點(diǎn)的數量與起始蛋白的數量不存在正相關(guān)，因為L(cháng)C-MS在使用相同的獲取參數時(shí)是飽和的。

為了評估GreenPhos在定量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)中的潛力，作者了鑒定的磷酸化肽與上機量之間的定量關(guān)系。以900μg為參照，在100、300和600μg中，檢測到的磷酸肽強度比與參考中磷酸肽強度比的中位數與理論值具有很好的相關(guān)性(圖3C)。分析結果表明，GreenPhos與單次LC-MS結合可用于從高達600μg的蛋白質(zhì)中定量磷酸肽，準確度高。通過(guò)5次重復質(zhì)譜分析，評價(jià)了GreenPhos在植物磷蛋白組定量鑒定中的再現性。5個(gè)生物重復和5個(gè)技術(shù)重復的磷酸肽強度的Pearson相關(guān)系數平均分別為0.95和0.97 (圖3D和3E)，表明具有較高的定量可重復性。從5個(gè)生物重復中共鑒定出磷酸化位點(diǎn)14063個(gè)，其中74%的磷酸化位點(diǎn)至少在2個(gè)重復中鑒定出 (圖3F)。結果表明，GreenPhos可以在定量和定性上產(chǎn)生高度可重復性的結果。

4.?利用GreenPhos對擬南芥鹽脅迫誘導的磷酸化蛋白組分析

為了深入了解擬南芥對鹽脅迫響應中蛋白磷酸化介導的信號，作者使用GreenPhos和單次LC-MS檢測，分析了100 mM NaCl處理30分鐘(T30)和120分鐘(T120)或未處理(T0)的擬南芥幼苗的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)(圖4A)。每個(gè)處理包括3個(gè)生物學(xué)重復，每個(gè)重復600μg蛋白用于磷酸肽的富集?？偣矎?316個(gè)磷酸化蛋白中鑒定出12908個(gè)磷酸肽，含有15889個(gè)磷酸化位點(diǎn)。在磷酸肽中，13473個(gè)磷酸位點(diǎn)在處理的至少一個(gè)重復中包含可量化的信息。

對三個(gè)重復中至少任意兩個(gè)重復中的11128個(gè)磷酸位點(diǎn)進(jìn)行了label free定量。采用p< 0.05篩選不同處理間存在差異的磷酸化位點(diǎn)。聚類(lèi)分析顯示，磷酸化蛋白形成了四個(gè)不同的簇，顯示了鹽脅迫誘導的磷酸化水平在所有處理中表現出顯著(zhù)差異(圖4B)。在簇1中，磷酸化水平在鹽脅迫30 min后適度下降，在120 min后升高。在簇2中，磷酸化水平在30 min時(shí)總體上升，而在120 min后維持在相似的水平。在簇3中，磷酸化水平在30 min時(shí)沒(méi)有顯著(zhù)變化，在120 min時(shí)下降。在簇4中，磷酸化水平在30 min鹽脅迫下下降，并在120 min時(shí)維持在類(lèi)似的水平。

使用Fisher’s-exact對每個(gè)簇中的磷酸化蛋白進(jìn)行GO和KEGG富集分析(圖5)。與報道一致，在細胞組分條目，細胞核、細胞質(zhì)和細胞膜蛋白在所有簇中被顯著(zhù)富集。在分子功能條目，激酶活性在簇1、2和4中富集，而在簇3中不富集，但是蛋白質(zhì)去磷酸化的在生物過(guò)程條目在簇3中富集。結果表明，激酶的磷酸化激活和磷酸酶的去磷酸化是鹽脅迫誘導的重要反應。

5.?磷酸化motif分析顯示鹽脅迫誘導多種激酶的差異激活

激酶通常通過(guò)識別特定的序列motif來(lái)磷酸化它們的底物，即磷酸化motif。使用motif-x算法?(https://meme-suite.org/meme/tools/momo)選擇在任意兩個(gè)處理中表現出差異水平的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行磷酸化motif分析。在處理T30/T0之間顯示磷酸化增加的磷酸化位點(diǎn)中，四個(gè)motif?(SP、SDxE、SDxD和LxxxxS)被過(guò)度表達，而兩個(gè)motif?(SP和RxxS)在顯示磷酸化降低的磷酸化位點(diǎn)中過(guò)度表達(圖6A)。同樣，在120 min鹽脅迫(T120/T0)下，在磷酸化位點(diǎn)中，分別有4個(gè)motif（SP、SDxE、SDxD和SxxE）和3個(gè)motif（SP、RxxS、SxxE）的水平升高或降低(圖6B)。兩種處理(T120/T30)的比較顯示，在120 min鹽脅迫下，兩個(gè)motif（SP、SD）和motif（SP）在磷酸化位點(diǎn)中被過(guò)度表達，分別表現出更高和更低的磷酸化水平(圖6C)。

在所有處理中，富含脯氨酸的motif (SP)在上調和下調的磷酸位點(diǎn)中都被過(guò)度表達，并且通過(guò)PRM進(jìn)一步驗證了β-淀粉酶1 (BAM1)上含有S55的一個(gè)motif (圖6)。緊接著(zhù)作者鑒定了5個(gè)CDPKs的12個(gè)磷酸位點(diǎn)和3個(gè)MAPK上的4個(gè)磷酸位點(diǎn)，包括MPK19激活環(huán)上的一個(gè)磷酸位點(diǎn)，這些激酶被認為和鹽脅迫相關(guān)。綜上所述，包括MAPKs和CDPKs在內的多種激酶在鹽脅迫中起作用。

6.?剪接體蛋白在鹽脅迫下發(fā)生不同程度的磷酸化

除了激酶外，在簇1、2和4中剪接體被KEGG通路顯著(zhù)富集 (圖5)，暗示磷酸化調控mRNA的可變剪接，是植物響應脅迫的關(guān)鍵過(guò)程。在鹽脅迫下，18個(gè)剪接體蛋白上共有28個(gè)不同的位點(diǎn)被差異磷酸化 (圖7)。利用PRM進(jìn)一步驗證了Y209在SCL30上的差異磷酸化(圖6)。據報道，RNA解旋酶及其磷酸化對剪接體的組裝至關(guān)重要。在鹽脅迫30分鐘后，Prp5的S210、S442和S444位點(diǎn)磷酸化增加，并在120分鐘后保持高水平，Prp19的多個(gè)亞基也觀(guān)察到類(lèi)似的磷酸化模式(圖7)。盡管這些差異磷酸化事件的意義尚未得到明確的證明，但它們可能參與了鹽脅迫誘導的mRNA剪接的調控。

研究總結

GreenPhos不僅極大地提高了植物磷酸化蛋白質(zhì)組的解析效率，而且也顯著(zhù)地減低了實(shí)驗操作的難度和成本，為更深入地理解蛋白質(zhì)磷酸化在植物生命過(guò)程中的功能提供了強有力的工具。該研究成果將有效推進(jìn)磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)與植物生物學(xué)和農學(xué)等領(lǐng)域的交叉融合，在發(fā)掘與作物產(chǎn)量、品質(zhì)以及抗逆密切相關(guān)的磷酸化蛋白及其位點(diǎn)中有著(zhù)廣泛的應用前景。

參考文獻：

Duan?X,?Zhang?Y,?Huang?X,?Ma?X,?Gao?H,?Wang?Y,?Xiao?Z,?Huang?C,?Wang?Z,?Li?B,?Yang?W,?Wang?Y.?GreenPhos,?a?universal?method?for?in-depth?measurement?of?plant?phosphoproteomes?with?high?quantitative?reproducibility.?Mol?Plant.?2023?Nov?27:S1674-2052(23)00393-3.?doi:?10.1016/j.molp.2023.11.010.?Epub?ahead?of?print.?PMID:?38018035.